Blood Taq DNA聚合酶（免提取）
產品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 保存 | 價格(元) |
Blood Taq DNA聚合酶（免提?。?/span> | D1010L1179 | 200 tests | -20℃ | 550 |
| D1010L1180 | 1000 tests | -20℃ | 2450 |
產品描述
Blood Taq DNA聚合酶來源于攜帶有突變的Taq DNA 聚合酶基因的E. coli 菌株，是截短后的Taq DNA聚合酶，缺失了N端的 5´結構特異性核酸內切酶結構域，缺失了N端的280個氨基酸；此外其基因內部發(fā)生了三個點突變。這些突變使它能夠耐受全血中存在的抑制劑, Blood Taq DNA聚合酶其他性能與常規(guī)Taq DNA聚合酶沒有較大差異。此酶能夠擴增人和小鼠全血樣品中的DNA而無需事先提純。Blood Taq DNA聚合酶在25 µL反應體系中能夠耐受高達20%的全血（50 µL反應體系中耐受30%）。
Blood Taq DNA聚合酶較其他同類產品單位活性高，單位反應成本低。
使用 Blood Taq DNA聚合酶擴增人全血。1:5%血液+Na-EDTA；2:5%血液+K-EDTA；3:5%血液+ Na-肝素；4:5%血液+Na-檸檬酸；5:含有人干血的1mm2 FTA GutherieCard；6:含有人干血的1mm2 FTA Card（50 µL水洗）。
運輸與保存方法
冰袋運輸。收到貨后-20℃避光干燥保存，1年有效。
使用方法
1. 反應體系配制。各組分在冰上*融化、混勻，按照下表進行加樣:
組分 | 25 µL | 50 µL | 終濃度 |
5X Bloot Taq Reaction Buffer | 5 µL | 10 µL | 1X |
10 mM dNTP | 0.5 µL | 1 µL | 0.2 mM |
10 µM Forward Primer | 0.75 µL | 1.5 µL | 0.3 µM (0.05-1 µM) |
10 µM Reverse Primer | 0.75 µL | 1.5 µL | 0.3 µM (0.05-1 µM) |
Whole Blood | up to 2.5 µL* | up to 10 µL** |
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Blood Taq DNA | 2 µL | 4 µL |
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Nuclease-free H2O | to 25 µL | 50 µL |
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* ≤10% Recommended in 25 µL reaction volume. ** ≤=20% Recommended in 50 µL reaction volume.
2. 加血液樣品。先將其它組分用移液器上下混勻，然后將血液加在管子底部。
3. 將PCR管轉移至95°C預熱的PCR儀，開始循環(huán)。
注：若反應體系中包含>10%的血液，*用50 µL 反應體系。
4. PCR反應。*PCR程序：通常為30-40個循環(huán)：
步驟 | 溫度 | 時間 |
Initial Denaturation | 95°C | 3 minutes |
30-40 Cycles (Typically 35) | 95°C | 20 seconds |
Final Extension | 68°C | 10 minutes |
Hold | 4-10°C |
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注意事項
1. DNA 模板: 全血樣品*用肝素鈉、Na-EDTA、K-EDTA或者檸檬酸鈉處理，雖然Blood Taq DNA聚合酶可以耐受30%（v/v）的全血樣品，但為了達到*擴增效果,5%–10%為建議的理想樣品量。干血如果存放在Guthrie卡或者903卡上(Whatman, NJ)，可以直接在25µL反應體系內加入1mm punch disc。如果血液存放在FTA paper (Whatman, NJ), 則先把 1mm punch disc在50µL dH2O中,50°C條件下孵育5分鐘，然后棄去50µL dH2O，把disc 直接放入25或50µL PCR 反應體系中。
2. 引物：理想引物長度在20–30個核苷酸，GC含量40–60%?？捎糜嬎銠C軟件輔助進行引物設計，諸如PrimerSelect™(DNAStar Inc, Madison, MI)或者Primer3等軟件在引物設計和分析時均表現(xiàn)良好。每個引物在反應體系中的終濃度為0.05–1μM, 0.3μM時表現(xiàn)更佳。
3. dNTPs: 每種dNTP*濃度為200 µM。
4. 冷敏感: Blood Taq DNA聚合酶增加了冷敏感性，包含部分熱啟動酶（Hot Start Taq）的特點，將反應體系至于冰上操作，并迅速置于95°C預熱的PCR儀可以將非特異性擴增降至zui低。
5. 變性溫度和時間: 在正式開始PCR循環(huán)前，*行95°C，3分鐘的預變性，可以確保血細胞得到充分解離并釋放出DNA模板。
6. 退火溫度和時間: *退火時間持續(xù)30秒到1分鐘，退火溫度可以通過梯度PCR進行優(yōu)化。梯度PCR時，退火起始溫度低于計算出melting temperature (Tm)5°C。
7. 延伸時間: *延伸溫度為68°C，zui后的延伸程序*為10分鐘，68°C。Blood Taq DNA聚合酶延伸速度為500bp/min.
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