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為了滿足客戶日常的分析需求，賽默飛 Th
Orbitrap Astral 質(zhì)譜儀集
賽默飛全新 Dionex
TM I
3月8日，賽默飛色譜質(zhì)譜業(yè)務(wù)迎來iCAP

毫克級電荷異構(gòu)體制備新突破，聯(lián)用質(zhì)譜助力生物制藥質(zhì)控升級

閱讀：152 發(fā)布時間：2024/10/8

　　遵循電荷異構(gòu)體檢測法規(guī)

　　引領(lǐng)精準(zhǔn)檢測技術(shù)新趨勢

　　近年來，蛋白類生物藥受到越來越多的關(guān)注和重視，2023年美國FDA批準(zhǔn)的新藥和生物制品名單中有24種蛋白藥物[1]?？贵w類蛋白藥物在生產(chǎn)、儲存和運輸過程中發(fā)生的潛在變化，可能會導(dǎo)致產(chǎn)品中發(fā)生分子量、氨基酸殘基的修飾、糖型等非均一性從而導(dǎo)致產(chǎn)生對應(yīng)的電荷異構(gòu)體。根據(jù)ICH Q6B的規(guī)定，生物制藥需要對電荷異構(gòu)體這種產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制，以確保產(chǎn)品的安全性、有效性和一致性，滿足各國藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)的要求。

　　在電荷異構(gòu)體的分析檢測中，全柱成像毛細(xì)管等電聚焦(icIEF)是一種不可或缺的分析手段，也是目前產(chǎn)品放行的法定方法。在2020版中國藥典《人用重組單克隆抗體制品總論》和2025版中國藥典公示稿《3129 單抗電荷變異體測定法》通則中都收錄了icIEF作為電荷異構(gòu)體檢測的藥典標(biāo)準(zhǔn)方法。AES(艾易爾斯生物)作為行業(yè)內(nèi)唯一能夠提供從載體兩性電解質(zhì)、卡柱、pI 標(biāo)記物到分析型、制備型和質(zhì)譜在線聯(lián)機(jī)的icIEF全方面解決方案的供應(yīng)商，與賽默飛強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)手共同推出icIEF-Orbitrap的聯(lián)用分析解決方案，并與國內(nèi)外生物制藥客戶合作發(fā)表系列研究成果，引領(lǐng)行業(yè)的發(fā)展[2-11]。

CEInfinite全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳與Orbitrap Exploris系列超高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀

應(yīng)對電荷異構(gòu)體分析三大難題

提升生物制藥質(zhì)控需求

　　隨著監(jiān)管要求的提高，藥物研發(fā)階段和某些生產(chǎn)控制階段需要制備毫克級電荷異構(gòu)體，以便用于肽圖分析、修飾位點確定和效力測定。然而，現(xiàn)有的icIEF技術(shù)在制備效率低、難以獲得毫克級電荷異構(gòu)體和制備重現(xiàn)性不佳方面存在行業(yè)難題。針對這些痛點，賽默飛與AES合作帶來了創(chuàng)新解決方案。

應(yīng)對挑戰(zhàn)一

攻克毫克級電荷異構(gòu)體制備挑戰(zhàn)，引領(lǐng)制備技術(shù)新突破

　　AES的CEInfinite平臺的制備型icIEF功能，能夠在無人值守的情況下實現(xiàn)高效且可重現(xiàn)的餾分收集。每次運行可自動完成足量的餾分收集，滿足肽圖譜分所需且能夠準(zhǔn)確定義每個餾分的間隔，實現(xiàn)每天20-30次的高通量操作，能夠快速提供大量可重現(xiàn)的樣品用于后續(xù)在Orbitrap高分辨質(zhì)譜上完成肽圖測試，為新藥的快速上市和生產(chǎn)流程的優(yōu)化提供強(qiáng)有力的支持。

　　高重復(fù)性：在遷移過程中可以保持峰形，從而確保高重現(xiàn)性

　　高分辨率和高純度：pI差異>0.1 的峰即可分餾制備，純度可以做到100%

　　高產(chǎn)量：制備量高達(dá) 8 μg/次，250 μg/天，4天即可獲得 1 mg

　　減少勞動力：自動化、溫控，并盡量減少用戶干預(yù)

圖1: CEInfinite采用壓力推動的制備模式，可以實現(xiàn)液相色譜級別的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

圖2: 離線制備 Pembrolizumab 電荷異構(gòu)體[5]

圖3: 制備獲得的Pembrolizumab 電荷異構(gòu)體的純度確認(rèn)[5]

圖4: Pembrolizumab 電荷異構(gòu)體中氧化修飾的信息匯總[6]

應(yīng)對挑戰(zhàn)二

提升電荷異構(gòu)體分析的分辨率和靈敏度

　　除了肽圖分析以外，CEInfinite icIEF 與Orbitrap 超高分辨質(zhì)譜儀聯(lián)用的優(yōu)勢，包括采用 Denative MS 和Native MS 模式，實現(xiàn) icIEF-Native MS 以進(jìn)行各種蛋白藥物進(jìn)行有效分析，這種集成解決方案不僅提升了蛋白質(zhì)電荷異構(gòu)體分析的分辨率和靈敏度，還確保了操作的高效性和數(shù)據(jù)的合規(guī)性，為生物制藥行業(yè)提供了一個先進(jìn)、可靠的分析平臺[10]。

　　高分辨率、高靈敏度的質(zhì)譜分析：Orbitrap具有極高的分辨率和靈敏度，使得蛋白質(zhì)電荷異構(gòu)體的分離和識別更加精準(zhǔn)，能夠檢測到低豐度的電荷異構(gòu)體，確保在復(fù)雜樣品中獲得可靠的數(shù)據(jù)，有助于發(fā)現(xiàn)和分析低濃度的蛋白質(zhì)變體，提升分析的全面性。

　　Native MS 模式：獨一無二的icIEF-Native MS 的模式，能夠在保持樣品天然狀態(tài)的情況下進(jìn)行質(zhì)譜分析。這對于 ADC藥物的電荷異構(gòu)體表征尤其重要，能夠準(zhǔn)確地分析復(fù)雜生物藥物的電荷異構(gòu)體，為藥物開發(fā)和質(zhì)量控制提供了強(qiáng)有力的工具。

　　統(tǒng)一管控滿足合規(guī)要求：變色龍軟件可以統(tǒng)一管理 CEInfinite icIEF 和 Orbitrap 的操作，提供強(qiáng)大的數(shù)據(jù)處理和管理功能，能夠有效存儲和分析數(shù)據(jù)，并提供數(shù)據(jù)審計跟蹤，可自動生成合規(guī)性文檔和記錄，滿足行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)要求。

圖5: 變色龍同時控制CEInfinite icIEF 和 Orbitrap Exploris 240[10]

圖6: 變色龍支持CEInfinite icIEF
的數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理[10]

圖7: CEInfinite icIEF與Orbitrap聯(lián)用在線檢測NIST mAb[2]

應(yīng)對挑戰(zhàn)三

藥物結(jié)構(gòu)復(fù)雜性帶來的電荷異構(gòu)體分離挑戰(zhàn)

　　隨著蛋白藥物從最初單抗已經(jīng)發(fā)展出了抗體偶聯(lián)藥物、小分子偶聯(lián)藥物、多肽偶聯(lián)藥物、抗體寡核苷酸偶聯(lián)物等各種新穎的藥物，這些藥物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性也給icIEF的分離帶來了挑戰(zhàn)，而只有得到很好的分離才能進(jìn)入下一步的制備工作，這里面最核心就是載體兩性電解液。

　　利用AESlyte®的載體兩性電解質(zhì)能夠顯著提高icIEF方法的分辨率，與傳統(tǒng)載體兩性電解質(zhì)相比，AESlyte系列不僅具有更嚴(yán)格的批次間質(zhì)量控制，還能夠在復(fù)雜樣品中實現(xiàn)更高的基線分辨率。另外通過優(yōu)化不同的AESlyte組合以及定制化載體兩性電解質(zhì)，CEInfinite平臺可以精確分離每個電荷異構(gòu)體，從而為后續(xù)的肽圖分析和質(zhì)量屬性研究奠定堅實基礎(chǔ)。

　　>30 個兩性電解質(zhì)覆蓋pH 2.5-12.0和>40 個pI標(biāo)記物從2.85 到 11.20。

　　定制的兩性電解質(zhì)可根據(jù)要求匹配之前使用其他兩性電解質(zhì)的歷史icIEF分析圖譜。

　　針對復(fù)雜蛋白如 ADC、雙特異性抗體、融合蛋白、AAV和脂質(zhì)納米顆粒進(jìn)行優(yōu)化，確保結(jié)果可靠且可重復(fù)，保證長期穩(wěn)定的供應(yīng)。

圖8: 現(xiàn)有的載體兩性電解質(zhì)產(chǎn)線圖

圖9: AESlyte載體兩性電解液用于NISTmAb和Etanercept

圖10: 現(xiàn)有的 pI 標(biāo)記物產(chǎn)線

　　提升質(zhì)控需求，助力應(yīng)對出海挑戰(zhàn)

　　電荷異構(gòu)體分析中，icIEF分析方法能滿足國內(nèi)外法規(guī)要求，icIEF-Orbitrap聯(lián)用技術(shù)能進(jìn)一步提升對生物制藥的質(zhì)控水平，生物制藥頭部跨國企業(yè)多家均配備了該套方案，以用于對生物制藥中電荷異構(gòu)體雜質(zhì)的管控，該方案能進(jìn)一步引領(lǐng)分析技術(shù)水平的提升，幫助國內(nèi)生物制藥企業(yè)應(yīng)對新藥出海的挑戰(zhàn)，增強(qiáng)競爭力！掃碼下方二維碼，一鍵獲取icIEF-MS電荷異構(gòu)體檢測最新方案！

　　 參考文獻(xiàn)：

　　1. T. Kwok, et al. Imaged capillary isoelectric focusing tandem high-resolution mass spectrometry using nano electrospray ionization (ESI) for protein heterogeneity characterization. Analytical Biochemistry 2023, 680, 115312. doi: 10.1016/ j.ab.2023.115312

　　2. W. Fan, et al. Integrating ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry and imaged capillary isoelectric focusing for in-depth characterization of complex fusion proteins. Rapid Communicationsin Mass Spectrometry. 2023, 37, e9484. doi: 10.1002/rcm.9484

　　3. T. Kwok, et al. Fractionation and online mass spectrometry based on imaged capillary isoelectric focusing (icIEF) for characterizing charge heterogeneity of therapeutic antibody. Analytical Methods.2023, 15, 411-418. doi: 10.1039/D2AY01670B

　　4. Zhang, et al. Imaged capillary isoelectric focusing (icIEF) tandem high resolution mass spectrometry for charged heterogeneity of protein drugs in biopharmaceutical discovery. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2023 224:115178. doi: 10.1016/j.jpba.2022.115178.

　　5. X. Zhang, et al. In Depth Characterization of mAb Charge Variants with icIEF Fractionation Followed by Peptide Mapping Analysis. ASMS poster,2021, PO66105.

　　6. G. Wu, et al. Mass Spectrometry-Based Charge Heterogeneity Characterization of Therapeutic mAbs with Imaged Capillary Isoelectric Focusing and Ion-Exchange Chromatography as Separation Techniques. Analytical Chemistry 2023, 95, 2548–2560. doi: 10.1021/acs.analchem.2c05071

　　7. X. Zhang, et al. Cutting-edge mass spectrometry strategy based on imaged capillary isoelectric focusing (icIEF) technology for characterizing charge heterogeneity of monoclonal antibody. Analytical Biochemistry, 2023, 660, 114961. doi: 10.1016/j.ab.2022.114961

　　8. Gang Wu, et al. Mass spectrometry study on SARS-CoV-2 recombinant vaccine with comprehensive separation techniques to characterize complex heterogeneity. Analytica Chimica Acta, 2024, 1297, 342348. doi: 10.1016/j.aca.2024.342349.

　　9. X. Zhang, et al. Imaged capillary isoelectric focusing – Mass Spectrometry (icIEF- MS) online coupling for polatuzumab vedotin charge heterogeneity analysis using native MS. ASMS poster ,2024, PO258

　　10. 艾易爾斯生物科技公眾號文章：文章分享丨為您更新：icIEF領(lǐng)域全新進(jìn)展