2022/09   —— 賽默飛擴(kuò)展您的科研視野

十年磨一劍，創(chuàng)新yong不停。值此金秋丹桂飄香之際，賽默飛重磅推出了三合一質(zhì)譜系列的dian峰之作——Thermo Scientific™ Orbitrap Ascend 三合一質(zhì)譜系統(tǒng)。這是繼Orbitrap Eclipse 三合一質(zhì)譜之后的再一力作，也是近10年來(lái)三合一質(zhì)譜*大的革新。

Orbitrap Ascend質(zhì)譜在提升整體性能和使用簡(jiǎn)便性的同時(shí)，旨在解決生命科學(xué)研究中的挑戰(zhàn)，在蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定、定量蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物制藥分析、以及小分子復(fù)雜性樣品研究等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力。本期小編將帶領(lǐng)大家來(lái)一段Orbitrap Ascend質(zhì)譜應(yīng)用之旅，以期借助我們的介紹，以小致大，讓賽默飛伴行您的科研之路，助力您拓展研究視野。

Orbitrap Ascend  

全新升級(jí)

在質(zhì)譜領(lǐng)域的漫漫長(zhǎng)河里，新的技術(shù)嘗試層出不窮，各式各樣的質(zhì)譜產(chǎn)品也曾豐富著這個(gè)市場(chǎng)。截止到目前為止，在z ui經(jīng)典、z ui耐用的質(zhì)譜主要為四極桿、離子阱、基于傅里葉變換的FT和Orbitrap，以及飛行時(shí)間質(zhì)譜，這幾類產(chǎn)品及其組合組成了目前市場(chǎng)上主要的質(zhì)譜產(chǎn)品。2013年，基于四極桿、離子阱和Orbitrap質(zhì)量分析器的三合一質(zhì)譜橫空出世，集超高的分辨率、靈敏度、穩(wěn)定性及各項(xiàng)擴(kuò)展功能于一體，一經(jīng)推出即獲得了廣泛的關(guān)注，*大地驅(qū)動(dòng)了生命科學(xué)等領(lǐng)域的認(rèn)知和應(yīng)用。

△圖1：Orbitrap Ascend  三合一質(zhì)譜儀

如今離第一款發(fā)布的三合一質(zhì)譜Fusion的發(fā)布已近10年，最新型的三合一質(zhì)譜儀Orbitrap Ascend質(zhì)譜的革新成為了近10年來(lái)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化最大的一次。

簡(jiǎn)而言之，

Orbitrap Ascend主要的革新在于4個(gè)層面：

（1）采用更溫和的離子漏斗技術(shù)，減少易碎裂物質(zhì)的源內(nèi)裂解水平，提高檢測(cè)限，減少假陽(yáng)性；

（2）C-Trap 前全新增加多級(jí)離子通道，用于常規(guī)離子儲(chǔ)存和MS²碎裂，提升靈敏度和掃描速度；后面的多級(jí)離子通道依然用于CID、 ETD, UVPD, PTCR and MSⁿ HCD ，保持了系統(tǒng)的多功能性；

（3）采用全新傳輸模塊，提高高質(zhì)量端離子傳輸效率，離子的掃描范圍擴(kuò)大至m/z 16000（選配HMR?+模式）;

（4）全新的自動(dòng)校正離子源，自定義校正的時(shí)間和周期，儀器自動(dòng)進(jìn)行校正，從而維持系統(tǒng)在最佳性能狀態(tài)；

形成了我們今天所看到的Orbitrap Ascend 三合一系統(tǒng)。

△圖2 Orbitrap Ascend三合一質(zhì)譜內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖

（點(diǎn)擊查看大圖）

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Orbitrap Ascend

應(yīng)用領(lǐng)域的更新

Orbitrap Ascend  核心模塊的革新，帶來(lái)的是功能上的升級(jí)，以應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)靈敏度和通量、生物制藥、結(jié)構(gòu)生物學(xué)及小分子應(yīng)用中不斷出現(xiàn)的挑戰(zhàn)，從而擴(kuò)展研究的深度和范圍。

△圖3 Orbitrap Ascend三合一質(zhì)譜應(yīng)對(duì)

生命科學(xué)研究中的挑戰(zhàn)（點(diǎn)擊查看大圖）

2.1  常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定

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蛋白質(zhì)組學(xué)一直是后基因組學(xué)時(shí)代重要的研究領(lǐng)域之一，如何提高蛋白質(zhì)的覆蓋度，提升鑒定深度和廣度，一直是科學(xué)家們研究的方向之一。Orbitrap Ascend 質(zhì)譜采用前置的IRM 提高了離子傳輸效率，靈敏度和掃描速度。

我們采用1 ug HeLa, 50 cm 色譜柱上樣，30分鐘和45分鐘分別可以鑒定到6137和6621個(gè)蛋白；46992和56175條肽段。蛋白和肽段的鑒定數(shù)量在相同時(shí)間下增加了15%和34%。有效的提升了分析的通量，降低實(shí)驗(yàn)成本。

△圖4 Orbitrap Ascend有效提升蛋白和肽段

鑒定數(shù)目（點(diǎn)擊查看大圖）

2.2  翻譯后修飾

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然而，細(xì)胞的許多生命過(guò)程不僅與蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度相關(guān)，還受時(shí)空分布可逆的翻譯后修飾控制。因翻譯后修飾的蛋白的豐度往往較低，且并非很穩(wěn)定，因此對(duì)儀器的性能提出了更高的要求。

Wisconsin-Madison學(xué)校的Josh Coon 實(shí)驗(yàn)室針對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化的研究顯示，Orbitrap Ascend 質(zhì)譜可檢測(cè)到12050條磷酸化肽段，8821個(gè)磷酸化位點(diǎn)。相比于前一代的產(chǎn)品，有18~25% 的提升。Coon 博士也對(duì)Ascend 系統(tǒng)的性能有著很高的評(píng)價(jià)，通過(guò)擴(kuò)大磷酸化肽段的覆蓋度，提升信號(hào)通路深度挖掘或藥物活性細(xì)胞機(jī)制的檢測(cè)能力。

△圖5 Orbitrap Ascend有效提升PTM 磷酸化肽段

和位點(diǎn)數(shù)目（點(diǎn)擊查看大圖）

2.3  定量蛋白質(zhì)組學(xué)—TMT定量

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TMT標(biāo)記定量采用混樣一次上機(jī)多個(gè)樣本進(jìn)行分析，可以大大的提升分析的通量。目前已推出了TMTpr 18-plex，一次性可以分析18個(gè)樣品。相對(duì)于常規(guī)LFQ 定量來(lái)說(shuō)，TMT定量不單提高了分析的通量，同時(shí)具有更少的缺失值，數(shù)據(jù)記錄更為完整。

哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Steven Gygi 團(tuán)隊(duì)采用4個(gè)細(xì)胞系，12個(gè)高pH餾分分級(jí)，結(jié)合SPS MS³及實(shí)時(shí)搜索功能，定量了83386條肽段， 8788的蛋白。Gygi 博士表示，500個(gè)蛋白鑒定數(shù)量的差異，對(duì)于65分鐘梯度來(lái)說(shuō)非常顯著，提升了定量蛋白研究的深度。

依賴于Ascend 系統(tǒng)更快的掃描速度及靈敏度，以及實(shí)時(shí)檢索，可顯著提高低上樣量樣品肽段和蛋白的鑒定數(shù)量（酵母酶解肽段，圖7），并進(jìn)一步提高SPS-MS³的定量準(zhǔn)確性。

△圖7  Orbitrap Ascend顯著提高TMT定量肽段

數(shù)目和通量（點(diǎn)擊查看大圖）

2.4  結(jié)構(gòu)生物學(xué)及生物藥分析

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Ascend 質(zhì)譜采用了新型離子傳輸模塊，有效的提高高質(zhì)量端離子傳輸效率，離子的質(zhì)量范圍擴(kuò)展至m/z 16000（選配的HMR?+模式）。在蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)解析及蛋白質(zhì)與小分子共價(jià)結(jié)合分析領(lǐng)域中，更高的質(zhì)量范圍可以有效提高蛋白質(zhì)的檢測(cè)范圍。

采用選配的HMR?+結(jié)合多種碎裂方式，針對(duì)細(xì)菌中分子量約800 kDa的伴侶蛋白家族的蛋白質(zhì)GroEL進(jìn)行分析，在m/z 12,000左右可以清晰的表征。

△圖8  細(xì)菌中伴侶蛋白家族的蛋白質(zhì)

GroEL分析（點(diǎn)擊查看大圖）

在完整蛋白分析中，提升檢測(cè)的質(zhì)量范圍只能解決一部分問(wèn)題。如何降低譜圖的復(fù)雜性，提供更多可供解析的譜圖是另一個(gè)核心點(diǎn)。當(dāng)?shù)鞍追肿釉酱?，帶電荷?shù)就越復(fù)雜，很難解析出明確的帶電荷數(shù)目。另外，由于共流出的存在，往往存在譜圖非常復(fù)雜，造成可供解析的譜圖較少。

選配的質(zhì)子轉(zhuǎn)移電荷減少技術(shù)（PTCR）通過(guò)將蛋白質(zhì)帶有的質(zhì)子轉(zhuǎn)移給全氟 (十四氫菲)離子，從而造成蛋白質(zhì)本身電荷逐漸減少，形成一系列電荷減少的離子，再通過(guò)相鄰價(jià)態(tài)離子間的質(zhì)荷比間距即可計(jì)算出蛋白質(zhì)的電荷數(shù)目。在對(duì)細(xì)胞因子-Fc 融合蛋白進(jìn)行分析時(shí)，采用PTCR技術(shù)與HMR?+ 的組合，簡(jiǎn)化的譜圖將有助于去卷積。在m/z 5900~6050 這2個(gè)PTCR譜圖中，可以鑒定10 種完整糖型，從而從復(fù)雜混合物中解析到更多的蛋白質(zhì)。

△圖9 PTCR技術(shù)去唾液酸化的Cytokine-FC

蛋白分析（點(diǎn)擊查看大圖）

2.5  全自動(dòng)校正離子源

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在大隊(duì)列分析中，需要保持儀器一直處于最佳狀態(tài)，Ascend 系統(tǒng)在易用性上也做了極大的改進(jìn)?？梢愿悄芑摹⒆詣?dòng)化的來(lái)對(duì)儀器進(jìn)行校正。我們只需要設(shè)定個(gè)校正周期，選擇好時(shí)間；軟件會(huì)自動(dòng)開(kāi)始運(yùn)行校正的項(xiàng)目。從而節(jié)省出時(shí)間，并且一直維持儀器在一個(gè)良好的狀態(tài)。一般推薦每周校正一次即可。

質(zhì)譜技術(shù)極大地驅(qū)動(dòng)了生命科學(xué)、制藥以及食品環(huán)境領(lǐng)域的長(zhǎng)足進(jìn)步。這次發(fā)布的Ascend 系統(tǒng)，無(wú)論是在常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)；定量蛋白質(zhì)組學(xué)；PTM 分析；完整蛋白質(zhì)表征、生物制藥分析；還是偏向于小分子的代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)、代謝流等領(lǐng)域；Orbitrap Ascend質(zhì)譜都可以提供強(qiáng)大靈活的功能相匹配，提升科學(xué)家們研究的深度和廣度。