細胞分離液

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Percoll不連續(xù)密度梯度沉淀法分離純化淋巴細胞和淋巴母細胞
（一）原理
Percoll是一種包有乙***的硅膠顆粒。滲透壓很低（<20mosm／kg H２O）, 粘度也很小，可形成高達1.3g／ml密度，采用預先形成的密度梯度時可在低離心力（200～1000g）于數(shù)分至數(shù)十分鐘內達到滿意的細胞分離結果。由于Percoll擴散常數(shù)低，所形成的梯度十分穩(wěn)定。此外，Percoll不穿透生物膜，對細胞無毒害，因此廣泛用于分離細胞、亞細胞成分、細菌及病毒，還可將受損細胞及其碎片與完好的活細胞分離。
（二）操作方法及注意事項
1.不同濃度（密度）Percoll溶液的制備: 先用9份Percoll與1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合達到性滲透壓，然后用溶液（0.85％ NaCl或0.15M PBS）稀釋到所需濃度。
Percoll濃度（％）　 70　     　60　     50　     40　      30　　  20
比重g／ml　          1.090      1.077      1.067    1.056     1.043     1.031
 2.不連續(xù)密度梯度Percoll層的制備: 先將試管壁用牛血清濕潤，除去多余血清，這種預處理可使逐層疊加的Percoll液平穩(wěn)沿管壁流下，使形成滿意的界面。在制備過程中一般用長針頭注射器從高密度向低密度逐層放置，有時相鄰兩層Percoll比重相差不大時，可將Percoll液放入注射器中，小針頭斜面緊貼管壁，任其自然慢慢流下。
 3.裝樣：樣品體積和細胞濃度根據(jù)不同細胞而異，一般加樣體積不宜過大，細胞濃度也不可過高，否則會影響細胞的分離和回收。
 4.離心：一般采用離心力為400g，時間20～25min。由于多層Percoll之間密度差別不大，因此離心機加速、降速時要慢，要平穩(wěn)。
 5.取樣：當所要分離的細胞絕大部分在兩層的界面時，可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細胞;有時大部分細胞位于Percoll層中,則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細胞經2次洗滌后可供培養(yǎng)或檢測用。
（三）分離純化細胞舉例
1.富含NK活性大顆粒淋巴細胞（LGL）的純化:按順序由下向上逐層加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五種不同密度的Percoll,如用10ml試管（或塑料管）分離,每層Percoll約1.2～1.5ml，初步從外周血中分離的PBMC細胞1×10８懸于１ml培基中，按要求裝樣、離心和取樣。一般富含NK殺傷活性的LGL細胞位于42.5％與45％Percoll界面以及上下二層的Percoll液中。
 2.純化淋巴母細胞和細胞：分別疊加50％和30％Percoll液。收取經PHA（或其它抗原、有絲分裂原）刺激PBMC,或含有較高比例異型的PBMC（如腎綜合征出血熱患者），按要求裝樣、離心和取樣。位于管底的淋巴細胞為小淋巴細胞；兩層Percoll之間為淋巴母細胞，純度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死細胞。收獲淋巴母細胞可進行表型、結構以及功能的研究。
（四）人不同血細胞的漂浮密度表　人不同血細胞的漂浮密度
細　胞漂浮密度細　胞漂浮密度
紅細胞1.09-1.11淋巴細胞1.052-1.077
粒細胞　B淋巴細胞1.062-1.075
嗜酸性1.09-1.095T淋巴細胞1.065-1.077
嗜中性　1.080-1.085淋巴母細胞1.065-1.077
單核細胞1.050-1.066自然殺傷細胞1.050-1.070
血小板1.030-1.060　　

（五）問與答
問：請問percoll連續(xù)梯度怎么配制？比如15%---75%的percoll連續(xù)梯度?
答：根據(jù)你需要的具體密度梯度決定的，根據(jù)要分離的不同細胞種類，數(shù)量等等，也有用原液配的。也有用80％配的，不一定的。另外，percoll本身是低滲透壓的，要用高滲透壓溶液配成等滲透壓溶液，然后使用，不然，細胞容易破裂。一般是先用9份Percoll與1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合達到性滲透壓，然后用溶液（0.85％ NaCl或0.15M PBS）稀釋到所需濃度。即取Percoll原液與10倍濃縮的PBS以9：1的比例混合，此時溶液 為100％ Percoll，比重是1.127，毫克分子滲透壓濃度為290mOsmol/kg。
（六） Percoll優(yōu)點
Percoll是經過聚乙*** （polyvinyl pyrolidone, PVP） 處理的硅膠顆?；鞈乙?，對細胞無毒性和刺激性。Percoll混懸液的硅膠顆粒大小不一，經過高速離心后，可形成一個連續(xù)密度梯度，將比重不同的細胞分離純化。 
因為Percoll具有滲透性低、不穿透細胞、粘度低、密度高和無毒害等優(yōu)點，與目前常用的密度梯度離心介質，包括蔗糖（Sucrose）、血清白蛋白（Serum albumin, ALB）、聚蔗糖（Ficoll）、氯化銫（CsCl）等相比，是目前較理想的介質。Percoll密度梯度離心已被多次成功地用于動物細胞及其細胞器的分離，純化了包括人血液細胞、骨髓細胞、紅血球細胞、白血球細胞、淋巴細胞、肝細胞等在內的十余種動物細胞。這一技術也開始用于用于分離和純化植物原生質體、核、葉綠體和線粒體。