聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)條件與循環(huán)參數(shù)詳述

       PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可以選擇性擴(kuò)增一段DNA序列。其基本步驟是，首先將待擴(kuò)增的模板DNA變性使之成為單鏈，DNA樣品中，特異性的引物能夠與其互補(bǔ)的序列雜交，在dNTPs和Taq酶存在時(shí)，就可以合成模板DNA的互補(bǔ)鏈，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物加熱使DNA雙鏈變性，溫度下降后，過量的引物又可以開始第二輪的合成反應(yīng)。這種延伸-變性-退火-延伸的循環(huán)可以重復(fù)多次，使所需要的DNA片段得到特異性的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)在生物體外大量擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，其特點(diǎn)是可以以微量的DNA為模板，快速擴(kuò)增得到大量拷貝。

一、PCR反應(yīng)條件的控制：
1.  PCR反應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。 
2.  鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L?！?br />3.  底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200 umol/L。　
4.  TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）?！　?br />5.  引物 濃度一般為0.1 ～0.5 umol/L。
6.  反應(yīng)溫度
（1）變性溫度和時(shí)間95℃，30 s。
（2）退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
（3）延伸溫度和時(shí)間72℃，1 min/kb(10 kb內(nèi)）。
（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)
7.  循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺期”。

二、PCR的循環(huán)參數(shù)：
1.  預(yù)變性（Initial denaturation）
模板DNA全變性與PCR酶的全激活對PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。

2.  循環(huán)中的變性步驟
循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列全變性，可能的情況下可 縮短該步驟時(shí)間，變性時(shí)間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹di，易造成擴(kuò)增失敗。

3.  引物退火（Primer annealing）
退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。
 

4.  引物延伸
引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。但在擴(kuò)增長度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長短而定，一般推薦在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1 min/kbp。

5.  循環(huán)數(shù)
大多數(shù)PCR含25-40循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。

6.  最后延伸
在最后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。