引言

慢病毒（Lentivirus，LV）作為一種優(yōu)秀的病毒載體，被成熟運(yùn)用于細(xì)胞免疫治療中，尤其是在Car-T療法中的廣泛運(yùn)用，為腫瘤和免疫疾病的治療帶來了新的方向。

慢病毒來源于人免疫缺陷病毒，是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種。它通過將外源基因整合到宿主基因序列中，可以實(shí)現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定表達(dá)。目前使用的慢病毒經(jīng)過科學(xué)家對(duì)膜蛋白的改造、去除復(fù)制相關(guān)基因和毒性基因等操作，獲得較高的安全性和廣泛的宿主感染能力，同時(shí)具有本身裝載容量大、可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定外源基因表達(dá)的特點(diǎn)。

慢病毒的結(jié)構(gòu)和特性使其在基因治療中具有優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)也對(duì)生產(chǎn)和純化提出了挑戰(zhàn)：

目前，慢病毒的生產(chǎn)通常通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞進(jìn)行貼壁/懸浮培養(yǎng)，其工藝流程包括以下幾個(gè)步驟：HEK293細(xì)胞培養(yǎng)、澄清、核酸酶處理、超濾濃縮、層析純化、超濾換液和除菌過濾。

慢病毒的活性需要依靠完整的包膜結(jié)構(gòu)，但其包膜上的某些糖蛋白對(duì)高溫、剪切力、鹽濃度都敏感，包膜容易受到破壞導(dǎo)致病毒失活。

因此，在生產(chǎn)過程中要注意條件控制，例如超濾環(huán)節(jié)可采用300~750KD中空纖維柱，有效降低剪切力和壓力，控制剪切力＜4000/s-1，TMP為3~7psi，濃縮5~10倍。在層析步驟，要注意減少慢病毒與高鹽條件的接觸時(shí)間，適當(dāng)添加穩(wěn)定劑。慢病毒體積較大，采用0.22μm濾器進(jìn)行除菌過濾收率一般只有60%~70%，為提高收率，生產(chǎn)過程可采用無(wú)菌生產(chǎn)工藝。對(duì)于工藝過程中慢病毒的回收率，需要重點(diǎn)考察感染滴度回收率，可采用QPCR或FACS法檢測(cè)感染滴度。

慢病毒的純化策略

值得注意的是，慢病毒對(duì)高鹽敏感，陰離子交換純化過程中常用的NaCl 500mM以上洗脫后需迅速稀釋至200mM以下，避免對(duì)病毒結(jié)構(gòu)的破壞。慢病毒在1M NaCl接觸1小時(shí)后，其感染活性會(huì)損失50%左右。同時(shí)，建議在整個(gè)純化過程中添加5%蔗糖作為穩(wěn)定劑，進(jìn)一步保護(hù)病毒的活性。

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