產(chǎn)品推薦:原料藥機械|制劑機械|藥品包裝機械|制冷機械|飲片機械|儀器儀表|制藥用水/氣設備|通用機械

技術中心

制藥網(wǎng)>技術中心>應用案例>正文

歡迎聯(lián)系我

有什么可以幫您? 在線咨詢

Protein A親和填料的清潔和壽命

來源:百林科醫(yī)藥科技(上海)有限公司   2024年05月31日 09:11  
 

 

得益于Protein A 親和填料
 
對抗體的高選擇性體積去除率以及
 
穩(wěn)健的雜質(zhì)去除效果。
 

 

 
Protein A 親和填料作為抗體藥生產(chǎn)的行業(yè)標準
 
  由于Protein A結合能力的局限性以及與Protein A樹脂相關的高成本,提高填料使用壽命的需求變得尤為重要。一般認為Protein A 填料的重復使用壽命由填料水解和填料污垢兩個因子所影響。
 
  Protein A填料水解是指配基長時間暴露在清潔溶液(如氫氧化鈉)中的降解。Protein A填料污垢是由于使用無效清洗液導致雜質(zhì)在填料表面不斷積累導致。

 

 
  填料配基水解(hydrolysis)  
 
  將全新的填料用不同濃度的堿性溶液循環(huán) >250 小時來檢測Protein A配基的水解速率,評估不同氫氧化鈉的濃度和溫度,用填料的DBC的下降數(shù)據(jù)來指征Protein A的填料水解速率。從圖1 中可看到,高濃度的氫氧化鈉導致更高的配基水解速率,此外低溫能緩解一定的配基水解。

圖1,氫氧化鈉濃度和溫度對DBC的影響

 
  以上數(shù)據(jù)表明在低溫條件下可緩解配基水解速率,不同分子的DBC對低溫具有不同的敏感性。以7個模型蛋白作為代表來研究不同分子在不同溫度下的DBC,其中分子B是pI為7.9的Fc融合蛋白,其余為pI范圍為6.5-8.9的IgG1單克隆抗體。如圖2,可以看到不同分子對低溫有不同程度的載量降低,這在一定程度上將抵消低溫下對配基水解帶來的好處。同時,在生產(chǎn)過程中在冷環(huán)境內(nèi)進行Protein A層析清晰步驟還可能在層析柱上產(chǎn)生放氣效應(outgassing),不利于生產(chǎn)制造,所以低溫下氫氧化鈉清洗并不是理想的解決方案。

圖2,使用添加劑來延緩配基的水解

 
  選定不同的添加劑對配基水解具有不同的延緩效果,以分子E為代表,分別添加蔗糖、乙二醇和丙二醇作為氫氧化鈉的添加劑,評估其清潔液循環(huán)之后的DBC。由圖3可知,添加劑對配基水解的延緩有一定的作用,丙二醇/蔗糖和乙二醇的配體穩(wěn)定性分別比0.1 M NaOH的基礎情況提高了2倍和3倍。

圖3,比較堿性清潔溶液和
非堿性清潔溶液的填料污垢

 
  選定3種分子(1個單抗+2個Fc融合蛋白)做為代表研究填料清洗后的污垢。為了最大程度上污染層析柱,3個代表分子的澄清收獲液在Protein A的層析柱上進行10個cycle,每個cycle只做到洗脫步驟,沒有做層析柱清潔,最后將層析柱拆下來分裝,分別用不同清洗液在不同溫度下孵育2小時,并用平衡液清洗3次,用原始的填料作為對照。此時填料上殘余的是清洗不干凈的污垢。將最后的填料懸浮液稀釋到1倍的SDS PAGE loading buffer中,80℃孵育10分鐘后取上清并進行SDS PAGE分析。SDS PAGE上越多蛋白表示越多的清洗不干凈的污垢。
 
  從圖4中可以清楚地看出,0.1M和0.3M(泳道2、4、5)濃度較高的氫氧化鈉作為清潔溶液的效果明顯優(yōu)于0.02M (泳道3)。這一趨勢在所有3種測試分子中都是一致的。0.3M NaOH對分子A的反應優(yōu)于0.1M NaOH,但對其他兩種情況的反應相當。此外,pH 11非堿清洗液(泳道 6)對分子A的清洗效果良好,但對其他分子的清洗效果不佳。這支持了無堿清洗液不適合作為平臺清洗策略的理論。有趣的是,溫度并沒有影響樹脂清洗的效率。在更高濃度的氫氧化鈉(0.3M)下,在環(huán)境溫度和低溫(泳道4和5)下都獲得了類似的結果。

圖4

 
  為了更好表征清洗時間對清洗效果,繼續(xù)以分子B為代表(Fc融合蛋白,pI 7.9), 用B分子污染的填料分別不同孵育時間。如圖5所示,隨著孵育時間增加,泳道的蛋白越少,清洗效果越好。但是增加孵育時間可能導致更多的配基降解,所以孵育時間和配基降解應該綜合考慮以取得最佳的填料壽命。

圖5,填料壽命研究

 
  根據(jù)以上數(shù)據(jù),選定0.1 M NaOH和0.1 M NaOH+20% EtGly為清潔溶液,評估其使用次數(shù)。由圖6可知,在添加了20% EthGly情況下層析柱壽命幾乎翻了一倍,且產(chǎn)品質(zhì)量未見下降。使用乙二醇作為添加劑來清潔親和層析柱會導致洗脫體積隨著循環(huán)數(shù)增加而緩慢增加,洗脫體積不影響相應的產(chǎn)品質(zhì)量,所以乙二醇任然可以作為親和層析的清潔添加劑。

圖6

 
  百林科Protein A 親和層析介質(zhì)MaXtar® ARPA,采用的高耐堿性的蛋白A配基,具有完全的自主知識產(chǎn)權,采用創(chuàng)新的綠色化學成球工藝、偶聯(lián)方式、配基,具有卓越的耐堿性能。在每個循環(huán)均使用0.5M NaOH,15min進行CIP處理,運行200個cycle以后,其動態(tài)結合載量(DBC)依然保留其原始載量的90%以上。

圖7

 

 

 
  參考文獻:
 
  Zhang J, Siva S, Caple R, Ghose S, Gronke R. Maximizing the functional lifetime of Protein A resins. Biotechnol Prog. 2017 May;33(3):708-715. doi: 10.1002/btpr.2448. Epub 2017 Mar 20. PMID: 28218470.
 
 

掃描二維碼,
百林科多款產(chǎn)品
均可試用!
 

  BioLink  
 

免責聲明

  • 凡本網(wǎng)注明"來源:制藥網(wǎng)"的所有作品,版權均屬于制藥網(wǎng),轉載請必須注明制藥網(wǎng),http://hg2288855.com。違反者本網(wǎng)將追究相關法律責任。
  • 企業(yè)發(fā)布的公司新聞、技術文章、資料下載等內(nèi)容,如涉及侵權、違規(guī)遭投訴的,一律由發(fā)布企業(yè)自行承擔責任,本網(wǎng)有權刪除內(nèi)容并追溯責任。
  • 本網(wǎng)轉載并注明自其它來源的作品,目的在于傳遞更多信息,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點或證實其內(nèi)容的真實性,不承擔此類作品侵權行為的直接責任及連帶責任。其他媒體、網(wǎng)站或個人從本網(wǎng)轉載時,必須保留本網(wǎng)注明的作品來源,并自負版權等法律責任。
  • 如涉及作品內(nèi)容、版權等問題,請在作品發(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,否則視為放棄相關權利。

企業(yè)未開通此功能
詳詢客服 : 0571-87858618