前言
日前的央視要聞報道中，樂純生物L(fēng)ePhinix®? 一次性生物反應(yīng)器作為上海重要科技創(chuàng)新成果出鏡。事實證明，從上游工藝、耗材環(huán)節(jié)創(chuàng)新突破，是賦能甚至反推中國生物制藥產(chǎn)業(yè)鏈全鏈條“做大做強”的必要條件。本次引發(fā)高層領(lǐng)導(dǎo)和媒體關(guān)注的一次性生物反應(yīng)器，是樂純生物于2022年推出的自研產(chǎn)品。一次性生物反應(yīng)器是典型的卡脖子產(chǎn)品。從所應(yīng)用到的生物工藝film薄膜到數(shù)字化控制系統(tǒng)，全部都有其技術(shù)難點。樂純生物L(fēng)ePhinix®? 一次性生物反應(yīng)器背后有扎實強大的研發(fā)支撐，在不斷推出新產(chǎn)品的同時，也形成了豐富的理論成果，定期在行業(yè)內(nèi)開源分享。
借本次機會，將該項目應(yīng)用技術(shù)負責(zé)人孫煥博士一篇技術(shù)干貨文分享給大家，看樂純生物如何攻克2000L一次生物反應(yīng)器的放大要點及難點。
純技術(shù)干貨，建議深閱讀——
生物工藝在逐級放大過程中，為保證細胞在相對恒定的環(huán)境中可實現(xiàn)穩(wěn)定的增殖和表達，通常在不同的規(guī)模下會采用相對變化的培養(yǎng)方式，在生物反應(yīng)器中實現(xiàn)最終的線性放大。
在前期進行細胞株開發(fā)時，多采用簡單的搖管或搖瓶篩選單克隆和培養(yǎng)基，并進行簡單的工藝策略摸索。
為能更好的摸索關(guān)鍵的工藝控制參數(shù)，如pH、DO、pCO2水平、連續(xù)補料的方式和速率等，后期的工藝開發(fā)越來越多采用智能化小型生物反應(yīng)器來進行工藝控制，以達到更好的培養(yǎng)效果，并方便依據(jù)鎖定工藝后的控制條件進行后期的工藝放大。
研發(fā)階段使用的罐體一般多種多樣，罐體的高徑比、槳葉形狀、槳葉直徑、攪拌形式、通氣方式和通氣孔徑，與放大后使用的罐體很難達到完全一致?？紤]到操作便利性和廠房高度等因素，多數(shù)供應(yīng)商不同體積罐體并不能實現(xiàn)等比例尺寸的放大，這就為后面的放大造成了一定的挑戰(zhàn)。
一般來說，放大主要從兩個維度來綜合考量，一方面是體積相關(guān)工藝參數(shù)的放大，如攪拌速度、通氣量等相關(guān)工藝條件，需要綜合反應(yīng)器的高徑比、槳葉直徑、P/V、混合時間、KLa等進行攪拌速率的換算，并通過表觀通氣速率和單位體積氣體流速擬定通氣量；另外一方面是非體積相關(guān)工藝參數(shù)的放大，包括補料速率、pCO2水平控制、通氣方式、通氣孔徑的選擇等，需要結(jié)合pH和DO的控制和細胞的耐剪切力水平，采用經(jīng)驗放大的方式來進行。
樂純生物L(fēng)ePhinix®? 2000L一次性生物反應(yīng)器CFD圖
a. LePhinix® 2000L 速度矢量圖(70rpm )
b. LePhinix® 2000L 湍流強度圖(70rpm)
c&d. LePhinix® 2000L 剪切強度分布圖
對于終端應(yīng)用客戶而言，細胞培養(yǎng)過程中的工藝放大多從以下幾個方面來考量：
恒定體積功率P/V
使用恒定的單位體積功率輸入(P/V)是哺乳動物細胞放大培養(yǎng)中常用的放大方法之一。反應(yīng)器的功率輸入(P)與槳葉的直徑(Di)和攪拌的轉(zhuǎn)速(N)成正向關(guān)系，槳葉的直徑越大，轉(zhuǎn)速越高，反應(yīng)器的功率輸入就越大。
不同的反應(yīng)器，相同槳葉直徑和轉(zhuǎn)速的情況下，由于槳葉形狀、角度、位置和尺寸大小的不同以及罐體的差異，功率常數(shù)(Np)不同，功率輸入也會有所變化。
單位體積的功率輸入：P/V=NpN3Di5ρ/V
其中：
• P —— 槳葉的功率輸入
• V —— 液體體積
• Np—— 功率常數(shù)
• N —— 槳葉轉(zhuǎn)速
• Di —— 槳葉直徑
• ρ —— 液體密度
在從小罐逐級放大到大規(guī)模體積培養(yǎng)的過程中，我們多遵循P/V值相對恒定的方式進行放大，在等P/V值的情況下，根據(jù)不同規(guī)模罐體槳葉直徑的變化，換算出轉(zhuǎn)速的差異。在對CHO細胞進行放大培養(yǎng)中，我們常用的P/V范圍一般會在10~30W/m3。同時，實際的操作過程中，也多參考供應(yīng)商或者歷史數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)速范圍進行轉(zhuǎn)速的微調(diào)。
恒定體積氣體流速vvm
在細胞放大培養(yǎng)的過程中，第二個重點關(guān)注的放大點，即是氣體流速。
一般來說，一次性生物反應(yīng)器會給予一個恒定的底部通氣和一個恒定的表層通氣，起始通氣速率一般為0.005vvm-0.01vvm，即50L體積的通氣量為0.25L-0.5L，200L的通氣量為1L-2L，2000L的通氣量為10L-20L。根據(jù)工藝的不同，一般空氣多通過大泡進行恒定速率的通氣，氧氣的通氣量根據(jù)細胞的氧氣消耗速率通過DO進行調(diào)控；當(dāng)消耗量比較大時，可采用微泡通氣的方式提高氣液傳質(zhì)效率。
氧氣傳質(zhì)系數(shù)KLa
KLa的評估多在選擇反應(yīng)器之初進行，這對于中試和商業(yè)化規(guī)模應(yīng)用至關(guān)重要。KLa反應(yīng)的是氣體的傳質(zhì)速率，是反應(yīng)器的槳葉設(shè)計、通氣孔徑大小、混合時間和氣體混合效率等的一個綜合評估指標(biāo)，評估的是反應(yīng)器的整體設(shè)計性能。
對于實驗室規(guī)模的生物反應(yīng)器，由于體積比較有限，通常更容易達到必要的氧傳輸速率。通常，根據(jù)實驗室規(guī)模系統(tǒng)中的培養(yǎng)結(jié)果，按照同等氣體傳質(zhì)效率的原則，參照選擇中試和商業(yè)規(guī)模的生物反應(yīng)器。
混合時間
混合時間在實際的放大過程中多做為參考。實驗室規(guī)模的小體積反應(yīng)器混合時間非常短，隨著規(guī)模變大，需要更高的攪拌速率來達到同樣的混合時間，或者在最大限速下無法達到小體積的混合時間。而且，更高的攪拌速率，會帶來更高的剪切應(yīng)力，特別對于高敏感細胞株，會帶來不可逆的細胞損傷。因此，規(guī)模變放大過程中會關(guān)注混合時間，但是并不會做為主要的放大依據(jù)。
CO2去除
規(guī)模放大的過程中，常遇到的一個問題是CO2的蓄積，且規(guī)模越大，蓄積效應(yīng)越加明顯。高濃度的CO2 往往會抑制細胞的生長代謝，甚至造成細胞毒性效應(yīng)，因此規(guī)模放大過程中常采用加大底部通氣量的方式來驅(qū)除CO2，并且采用高效的大泡通氣的方式。在較大規(guī)模，如采用1000L以上規(guī)模培養(yǎng)時，常規(guī)的提高底部通氣的方式進一步受到限制，因此設(shè)計上會采用單獨一路更大孔徑通氣孔進行通氣，以達到有效消除CO2蓄積的目的。
樂純生物細胞培養(yǎng)線性放大的王牌組合
樂純生物開發(fā)的LePhinix®?一次性生物反應(yīng)器涵蓋了50L至2000L，便利的上開門設(shè)計，左右兩側(cè)人性化的管路梳理裝置，頂部加入底部通氣濾器夾子，底部搭配水夾套設(shè)計，有效的滿足工藝應(yīng)用的需求。適配的LeKrius®?一次性生物反應(yīng)袋，頂部補料管路可根據(jù)反應(yīng)器高度適度加長方便焊接，底部通氣管路加入防液體倒流裝置有效降低操作失誤。
左：LePhinix®? 一次性生物反應(yīng)器全系列
右：LeKrius®?一次性生物反應(yīng)袋
同時，樂純生物強大的售前和售后支持團隊，可根據(jù)客戶要求進行一次性反應(yīng)袋的定制化設(shè)計和配置。
LePhinix®? 一次性生物反應(yīng)器規(guī)格
放大過程中的關(guān)鍵工藝控制點
生物反應(yīng)器放大過程中，除了最為關(guān)鍵的攪拌轉(zhuǎn)速和通氣速率等因素外，還應(yīng)通盤考慮整個工藝過程中的多重控制點，如培養(yǎng)基的過濾和收獲后的深層過濾，不同體積下補料的添加速率，體積變化導(dǎo)致的CO2控制策略變化，放大中的工藝參數(shù)偏移帶來的關(guān)鍵工藝指征有所轉(zhuǎn)變等等。濾器一般都可以直接通過線性放大的方式進行簡單放大，只是規(guī)模進一步放大過程中，操作時間的控制也需要綜合考慮進去。如溶液配制過程中，為了控制生物負載，需要控制配液的總時長。如細胞收獲步驟，為了提高收獲效率和保證蛋白質(zhì)量，需要反應(yīng)器進行降溫操作，并通過高通量和高流速實現(xiàn)控制收獲的總時間。
大體積培養(yǎng)基的配制過程，往往會出現(xiàn)小體積配制過程中意想不到的問題，如pCO2的控制失誤可能導(dǎo)致pH出現(xiàn)偏差，大量粉末的大批量加入帶來的粉塵問題，攪拌速度限制導(dǎo)致的粉末不能及時有效混合等等，因此在大體積的配制過程中選用的設(shè)施設(shè)備包括耗材等應(yīng)充分考慮這這些因素，如增加攪拌時間，使用投料袋、控制溶液的配制時長等等。另外，大體積的溶液儲存方式也會發(fā)生變化，加上配制時間的增長，這要求我們需要綜合考慮溶液的配制時間和儲存時間，進行合理的規(guī)劃。
除此之外，通氣的增加帶來的大體積培養(yǎng)過程中有效通氣速率和氣體儲量也是我們需要進行考量的；放大過程中的控制水平偏移可能導(dǎo)致的工藝觸發(fā)條件發(fā)生變化，如觸發(fā)降溫的時間將會發(fā)生變化，這就需要工藝轉(zhuǎn)移過程中除了關(guān)注降溫的時間，還應(yīng)該加入細胞密度這個最為關(guān)鍵的因素，以達到更加合理化控制的目的。
下周為大家具體解析樂純生物2000L 細胞培養(yǎng)放大的最新案例，敬請期待！
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