研發(fā)和生產(chǎn)中，提到內(nèi)毒素，腦袋里冒出的第一個想法是不是 “難纏的對手”？那么，如何給予“對手”強有效的致命一擊呢？別急，咱們接著聊。
內(nèi)毒素(Endotoxin)是復(fù)雜的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，構(gòu)成所有革蘭氏陰性菌外細胞壁的固有部分，并負責(zé)細胞壁的組織和穩(wěn)定性。它們由三個不同的區(qū)域組成：菌體特異性多糖、非特異性核心多糖和脂質(zhì)A。其中，脂質(zhì)A是其主要的毒性成分。
在細菌細胞死亡溶解或用人工手段破壞了細菌細胞結(jié)構(gòu)后，內(nèi)毒素會被釋放出來，對宿主造成毒性作用。對于內(nèi)毒素引起的毒性反應(yīng)，主要有發(fā)熱反應(yīng)、多器官功能衰竭、感染性休克、敗血癥、腦膜炎球菌血癥等。
內(nèi)毒素單體分子量約10KD左右，在不同成分的水溶液中，可形成大分子聚合體，最大可以超過1000 KD。內(nèi)毒素對熱有很強耐受性，只有160℃以上的高溫持續(xù)2~4 h，或者采用強酸、強堿、強氧化劑加熱煮沸30 min以上才能破壞其生物活性。
由于內(nèi)毒素的危害性，中國藥典和美國藥典對于內(nèi)毒素的檢查和要求都做了明確規(guī)定：在研發(fā)和生產(chǎn)過程中，除了確保無菌操作及所有與料液有接觸的設(shè)備、耗材、試劑等均無引入外源性內(nèi)毒素污染風(fēng)險的同時，采取必要且有效的工藝手段或工藝方法，降低或去除內(nèi)源性內(nèi)毒素污染，達到工藝要求，提高產(chǎn)品安全性。
去除內(nèi)毒素有多種工藝方法，層析技術(shù)目前也是從成本和有效性上比較突出的方法之一。利用內(nèi)毒素分子的不同性質(zhì)，可以采用不同原理的層析方法，其中，本文重點展示了層析方法中的離子交換層析法。
內(nèi)毒素含有脂質(zhì)A，而脂質(zhì)A中含有多個磷酸根結(jié)構(gòu)，等電點比較低，通常是3.1。當(dāng)溶液pH值高于其等電點時，內(nèi)毒素帶有部分的負電荷，可以結(jié)合帶正電的陰離子交換層析介質(zhì)。因此，可以利用強陰離子交換層析介質(zhì)結(jié)合內(nèi)毒素，目標(biāo)蛋白流穿的方式去除內(nèi)毒素。
其中，百林科可以提供不同的強陰離子交換層析介質(zhì)的選擇，如MaXtar Q、MaXtar Q HR、MaXtar Q HR XL、Q Chromstar BB、Q Chromstar FF、Q Chromstar HP、Q Chromstar XL、Q Chromstar BB XL等，根據(jù)不同的工藝要求，可以選擇不同的層析介質(zhì)。
MaXtar Q HR參數(shù)介紹
* 動態(tài)載量的測量條件：
裝柱高度：10 cm，測試流速150 cm/h ，測試緩沖液：0.05 M 乙酸鈉溶液，pH4.75，測試樣品：6 mg/ml 的BSA 樣品，當(dāng)BSA 的穿透量達到10% 時，單位介質(zhì)體積(ml) 的BSA 上樣量(mg)。
** 工作范圍:
在該pH值范圍內(nèi)，介質(zhì)的功能不發(fā)生明顯變化。
*** v/v：體積比
應(yīng)用案例：
質(zhì)粒純化中使用MaXtar Q HR去除內(nèi)毒素
? 層析柱：Chrom-Screen MaXtar Q HR 4.7ml；10 cm
? 上樣：親和純化后質(zhì)粒樣品(保留時間：5 min)
? 平衡液：0.4M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5
? 洗脫液：1.0M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5
MaXtar Q HR層析圖譜
小結(jié)：經(jīng)MaXtar Q HR填料純化后，內(nèi)毒素含量<5EU/mg，符合內(nèi)毒素控制的質(zhì)量要求。
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