竹節(jié)人參中氨基酸和皂甙特征組分的分析鑒別

摘要：建立了利用液相色譜法和紅外光譜法分析鑒別竹節(jié)人參中氨基酸和皂甙的特征組分的方法。分離了竹節(jié)人參中的皂甙和水溶性氨基酸，并對其中的Rb1和Rg1兩種人參皂甙以及17種氨基酸進行了定性分析；粗皂甙紅外圖譜的主要特征峰與Rb1一致。通過與的粗皂甙的紅外圖譜相比較，可鑒定藥品的真?zhèn)危环治鰳悠飞V圖中氨基酸和皂甙等成分的比例，可對該產(chǎn)品進行內(nèi)在品質(zhì)的鑒定。該方法簡便、快速，所得實驗結(jié)果代表性強，重現(xiàn)性良好。
關(guān)鍵詞：液相色譜；紅外光譜；特征組分；氨基酸；皂甙；竹節(jié)人參
竹節(jié)人參（Panaxjaponicus C．A．Mey．）是五加科人參屬植物竹節(jié)人參的干燥根莖，含有多種人參皂甙和三七皂甙，具有滋補強壯、墜血通經(jīng)、舒筋止痛、活血祛淤功能，主治跌打損傷、筋骨疼痛等，對五癆七傷均有*療效。
國內(nèi)關(guān)于與竹節(jié)人參同屬的中草藥人參和三七的功效成分及人參的色譜分析已有報道，但有關(guān)竹節(jié)人參的研究報道卻很少。對于竹節(jié)人參主要藥用成分皂甙的分析，大多只限于測定水解后的甙元，即齊墩果酸、人參二醇和人參三醇；對氨基酸的分析，一般也只用鹽酸水解后測定其中的17種氨基酸，其他氨基酸（包括色氨酸）均在水解過程中被破壞，且水解條件和測定方法不同，測定結(jié)果也不同。測定以上兩個項目均需水解，操作比較繁瑣，費時較長，且不能全面表達竹節(jié)人參所含的主要功效成分和對其品質(zhì)進行評價。近幾年又發(fā)展了利用特征組分對中藥材進行識別和對比的方法。
本文針對竹節(jié)人參中主要藥用成分是皂甙和氨基酸這兩大類物質(zhì)的特點，建立了利用液相色譜和紅外光譜法對竹節(jié)人參浸出物進行分離和內(nèi)在品質(zhì)鑒定的方法。該方法代表性強，重現(xiàn)性好，是一種快速、的分析方法，具有實用價值。
1 實驗部分
1．1 儀器與試劑
FTIR-8300紅外光譜儀（島津）；Waters Alliance色譜系統(tǒng)，包括Waters 2690分離單元、2487紫外檢測器和Millennium 32色譜管理系統(tǒng)。
對照品：人參皂甙Rbl、Rgl（中國生物制品檢定所）；17種氨基酸標準品（Waters公司）。
1．2 樣品制備
取竹節(jié)人參粉末1g，加水10mL，置于85℃烘箱中，保溫浸提過夜，用濾紙過濾，濾液用0.45μm濾膜過濾，取10μL于50mm×6mm i．d．衍生化試管中，按6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰氨基甲酸酯法（簡稱AccQ．Tag TM法）測定游離氨基酸。
取竹節(jié)人參粉末1g，加水約1mL，搖勻，加入用水飽和的正丁醇溶液10mL，密塞，振搖10min，超聲處理30min，放置過夜，用0.45μm針筒式過濾器過濾，殘渣用正丁醇反復(fù)洗滌2～3次，濾液合并，揮干正丁醇，得粗皂甙粉末。取粗皂甙粉末2mg，用于紅外分析；取粗皂甙粉末10mg，加0.5mL甲醇溶解，用于皂甙的特征組分分析。
1．3 分析條件
1．3．1 氨基酸特征組分分析的色譜條件 RPC18柱（3.9mm i．d．×150mm，填料為日本進El的5μm Fuji Silysia Cl8，自填），柱溫38℃；流動相A：140mmol/L乙酸鈉-17mmol／L,胺溶液（pH 5.05），流動相B：100％乙腈，流動相C：100％水，梯度洗脫；流速2.0mL／min；檢測波長248nm；進樣量8μL。
1．3．2 皂甙特征組分分析的色譜條件Nova-PakC18色譜柱（4μm，300mm×3.9mm i．d．，Waters公司）；流動相A：100％ H2O，流動相B：100％乙腈，梯度洗脫；流速1.0mL／min；檢測波長203nm；柱溫20℃ ；進樣量10μL。
1．3．3 紅外光譜分析條件 溴化鉀壓片法；掃描范圍400～4000/cm；分辨率2.0；掃描次數(shù)40。
2 結(jié)果與討論
2．1 氨基酸的特征組分分析
竹節(jié)人參的氨基酸特征組分圖譜。我們對其中的17種氨基酸進行了定性。在組成蛋白質(zhì)的氨基酸中，門冬氨酸（Asp）（3號峰）、精氨酸（Arg）（10號峰）、丙氨酸（Ala）（12號峰）、酪氨酸（Tyr）（17號峰）和賴氨酸（Lys）（22號峰）的含量較高；8種人體必需氨基酸有一定的含量；在酪氨酸之前未出現(xiàn)胱氨酸（Cys2）的吸收峰，證明不含胱氨酸；甲硫氨酸（Met）的峰很低，表明竹節(jié)人參中含硫氨基酸很少。因為對照品的限制，1，2，4，13，14，16，18和21號等8個峰還未能定性，是否為氨基酸尚不能確定，但根據(jù)AccQ．Tag TM法的特性，可知屬于氨基化合物。
對產(chǎn)品品質(zhì)的比較，可以各主要成分與參比組分峰面積或峰高的比值來確定。若以22號峰賴氨酸為標準，其余各已知組分相對于賴氨酸峰高的比例系數(shù)分別為：門冬氨酸1.74、絲氨酸（Ser）0.56、谷氨酸（Glu）0.48、組氨酸（His）0.11、甘氨酸（Gly） 0.41、精氨酸4.15、蘇氨酸（Thr）0.51、丙氨酸1.16、脯氨酸（Pro）0.71、酪氨酸1.47、纈氨酸（Va1）0.74、甲硫氨酸0.24、異亮氨酸（1ie）0.52、亮氨酸（Leu）0.65、苯丙氨酸（Phe）O.60和色氨酸（Trp）0.42。該法比較全面地反映了竹節(jié)人參中所含氨基酸的情況，且提取條件與藥物炮制過程十分相似，有利于研究各種成分與療效的關(guān)系。
2．2 粗皂甙的特征組分鑒別
正丁醇提取物為皂甙粗品，要逐一弄清其成分十分困難，且對照品只有人參皂甙Rb1和Rg1，因此采用甲醇溶解Rb1和Rg1，用雙波長吸收比或雙柱法確定圖中峰14和峰17分別為Rg1和Rb1，且Rb1和Rg1均有較高的吸收峰。Rb1和Rg1水解后分別得人參二醇和人參三醇，但實際上人參二醇和人參三醇在竹節(jié)人參水解產(chǎn)物中含量并不高（分別只有0.03％和0.02％，湖北測試中心測定），因此可以斷定Rb1和Rg1并非竹節(jié)人參中皂甙的主要成分。
為了消除提取物純度對指紋圖譜的影響，采用其他特征峰與分離較好的Rg1的比例來確定竹節(jié)人參的品質(zhì)較為適合。其他主要成分與Rg1峰高的相對比例系數(shù)分別為：3號0.24，5號0.43，12號0.48，15號0.43，16號10.69，17號（Rb1）1.36。
2．3 粗皂甙的紅外圖譜分析
竹節(jié)人參粗皂甙的紅外圖譜，在3416，2931，2876，1721，1619，1458，1259，1075，1045和553/cm等處出現(xiàn)了與人參皂甙Rb1相似的特征峰。紅外吸收光譜表征的是化合物的基團的振動或轉(zhuǎn)動能級的信息，因此一般只用作對純度≥98％的有機物單質(zhì)作定性鑒定。粗皂甙為混合物，雖然由于其中不同物質(zhì)不同基團的相互作用。使得某些吸收減弱或相互抵消，紅外圖譜變得相對簡單，但仍然可以通過與已知物質(zhì)比較或根據(jù)一些特征峰獲取
某些基團的信息。
在實際應(yīng)用中，如果以某地的竹節(jié)人參產(chǎn)品的皂甙粗品的紅外圖譜為標準，通過與之相比較，可鑒別假冒、偽劣產(chǎn)品（如以續(xù)斷與竹節(jié)人參同煮后冒充竹節(jié)人參等）。
2．4 方法的重現(xiàn)性
同一樣品按以上方法在不同時間重復(fù)浸提和測量6次，其紅外圖譜沒有差別，氨基酸和皂甙的主要特征峰保留時間的相對標準偏差（RSD）均在0.5％以內(nèi)，峰高比例的RSD均在1.5％以內(nèi)。
參考文獻：
[1] Xu Guojun，ShiDawen．Nuture Drugs．Beijing-People’s Medical Publishing House，1989．276
徐國均，施大文．生藥學．北京：人民衛(wèi)生出版社，1989．276