整體柱，以其大而均勻且相互貫通的流道設(shè)計(jì)，對流傳質(zhì)的層析原理，為生物大分子，特別是分子直徑在20nm以上、對剪切力較敏感的生物樣品，提供高收率、高載量、高分辨率及快速純化的層析解決方案。
今天，我們就來看看整體柱CIMmultusTM EV在外泌體純化中的應(yīng)用。
春風(fēng)得意外泌體
2013年，諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予了揭秘外泌體等囊泡的運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制的美國科學(xué)家James E. Rothman、Randy W. Schekman和德國科學(xué)家Thomas C. Sudhof，使得外泌體領(lǐng)域逐漸火熱。
外泌體是一種直徑在30-150nm之間的細(xì)胞外囊泡，它具有脂質(zhì)雙分子層，其內(nèi)可以包含多種物質(zhì)，比如核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，并表達(dá)跨膜蛋白和受體，可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)通信。
外泌體廣泛的分泌產(chǎn)生和存在于機(jī)體的各個(gè)部位，因此作為一種遞送載體，它有著良好的生物兼容性，較低的免疫原性，可以長久的存在于血液循環(huán)中，并且可以通過血腦屏障?；谶@些性質(zhì)，外泌體在診斷、治療都有著廣闊的應(yīng)用前景。
純化難，多歧路
盡管外泌體有著非常多的應(yīng)用優(yōu)勢，但是其在大規(guī)模生產(chǎn)中還是存在著許多技術(shù)挑戰(zhàn)。就純化過程而言：
• 現(xiàn)有的一些純化外泌體的方法，比如：超速離心、PEG聚合沉淀、免疫親和捕獲等方式，都存在一些技術(shù)限制，比如：無法滿足大規(guī)模外泌體分離的需求、成本高、特異性低等問題。
• 外泌體作為一種囊泡結(jié)構(gòu)，對純化條件和剪切力都非常敏感，傳統(tǒng)的分離方式，比如傳統(tǒng)顆粒填料層析，由于填料顆粒之間存在湍流，從而產(chǎn)生剪切力，對外泌體脂質(zhì)雙分子層的穩(wěn)定性和收率都會產(chǎn)生影響。
• 外泌體本身直徑較大，很難充分?jǐn)U散到填料顆粒內(nèi)部，從而導(dǎo)致載量較低。
• 外泌體屬于細(xì)胞外囊泡的一種，而細(xì)胞外囊泡中的微囊泡和凋亡小體都與外泌體有一定的相似度，較難分離，因此，需要采用一種高分辨率的分離方式。
使用整體柱，更上一層樓
整體柱CIMmultusTM EV，專為外泌體純化而設(shè)計(jì)，它能很好的解決外泌體層析純化中的一些問題。
• 對流傳質(zhì)原理結(jié)合微米級別的寬闊流道，適合分子直徑較大的外泌體樣品的純化，載量優(yōu)勢明顯。
• 層流的模式，無湍流，極低的剪切力，適合囊泡樣品的純化。
• 對流傳質(zhì)，無擴(kuò)散效應(yīng)，分辨率高，可以滿足分離不同類型細(xì)胞外囊泡的需求。
• 具有多種規(guī)格，可以實(shí)現(xiàn)良好的層析工藝放大。
圖1. 基于整體柱CIMmultusTM EV的外泌體純化解決方案
首先，在進(jìn)行整體柱純化之前，需要通過三步“TFF1-核酸酶解-TFF2”去除一定宿主細(xì)胞來源雜質(zhì)，這其中就包括較難去除的染色質(zhì)組分 (圖1)。第一步TFF的主要目的是去除會抑制核酸酶活性的物質(zhì)和部分雜質(zhì)；然后引入耐鹽核酸酶進(jìn)行酶解，選擇耐鹽核酸酶是需要在高鹽條件下將染色質(zhì)中核酸和蛋白的相互作用打開，以便充分降解。酶解處理結(jié)束后再通過第二步TFF去除酶及降解后的雜質(zhì)。
然后，使用CIMmultusTM EV整體柱進(jìn)行純化。純化推薦條件如下：
• 平衡緩沖液：50 mM HEPES, 20 mM NaCl, pH 7.0
• 洗脫緩沖液：50 mM HEPES, 2 M NaCl, pH 7.0(線性梯度洗脫0-100%B, 20CV)
• CIP溶液：1 M NaOH, 2 M NaCl
• 流速：5CV/min
圖2. CIMmultusTM EV整體純化推薦條件
通過如下檢測結(jié)果可以看到(圖3)，經(jīng)過最終CIMmultusTM EV純化后，sEV即外泌體得到了很好的富集和濃縮，同時(shí)，與bEV和mEV實(shí)現(xiàn)了明顯的分離。
圖3. 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞外囊泡的情況
整體柱CIMmultusTM EV是專為外泌體純化設(shè)計(jì)，從基質(zhì)到配基都為外泌體純化量身定制。同時(shí)，可提供各種規(guī)格的柱型從1mL至40L，具有良好的工藝放大性。
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