PCR引物設(shè)計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴(kuò)增模板DNA序列。如前述，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。對引物的設(shè)計不可能有一種包羅萬象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計。
1. 引物的特異性
引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補(bǔ)堿基同源。
2. 避開產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)區(qū)
某些引物無效的主要原因是引物重復(fù)區(qū)DNA二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計算機(jī)軟件可以預(yù)測估計mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實驗表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能(△G°)小于58.6 lkJ/mol時，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴(kuò)增的成功是有幫助的。
3. 長度
寡核苷酸引物長度為15~30 bp，一般為20~27mer。引物的有效長度：Ln=2(G+C)+(A+T+，Ln值不能大于38，因為>38時，最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度(74℃),不能保證產(chǎn)物的特異性。
4. G+C含量
G+C含量一般為40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。
5. 堿基礎(chǔ)隨機(jī)分布
引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。
6. 引物自身
引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。
7. 引物之間
兩引物之間不應(yīng)不互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3′端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應(yīng)多于4個連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。
8. 引物的3′端
引物的延伸是從3′端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCR(AS-PCR)反應(yīng)中，引物3′端不能發(fā)生錯配。
在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中，用2UTaqDNA聚合酶和800μmol/LdNTP(四種dNTP各200μmol/L)以質(zhì)粒(103拷貝)為模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增HIV-1gag基因區(qū)的條件下，引物3′端錯配對擴(kuò)增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。A∶A錯配使產(chǎn)量下降至1/20，A∶G和C∶C錯七下降至1/100。引物A：模板G與引物G：模板A錯配對PCR影響是等同的。
9. 引物的5′端
引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點；標(biāo)記生物素、熒光、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。
10. 密碼子的簡并
如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴(kuò)增特異性與效率。
特殊目的的引物設(shè)計將在有關(guān)章節(jié)討論。隨著人們對引物的認(rèn)識，一些引物的計算機(jī)設(shè)計程序也應(yīng)運而生，下面將討論有關(guān)引物計算機(jī)設(shè)計方法。
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