顯微鏡超薄切片技術制作：
由于電鏡電子束穿透能力的限制，必須把標本切成厚度小于0.1um以下的薄片才適用，這種薄片稱為超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。(單筒顯微鏡)
在透射電鏡的樣品制備方法中，超薄切片技術是最基本、的制備技術。超薄切片的制作過程基本上和石蠟切片相似，需要經(jīng)過取材、固定、脫水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步驟。
超薄切片主要步驟
取材、分割
固定
脫水
滲透、包埋
超薄切片
超薄切片染色
1取材、分割
1.1取材、分割的基本要求
組織從生物活體取下以后，如果不立即進行適當處理，會由于細胞內(nèi)部各種酶的作用，出現(xiàn)細胞自溶現(xiàn)象。此外，還可能由于污染，微生物在組織內(nèi)繁殖使細胞的微細結構遭受破壞。因此，為了使細胞結構盡可能保持生前狀態(tài)，必須做到快、小、準、冷。
(1)動作迅速，組織從活體取下后應在最短時間內(nèi)(爭取在1分鐘內(nèi)) 投入2.5%戊二醛固定液。
(2)體積要小，一般不超過0.5mm×0.5mm×0.5mm。也可將組織修成1mm×1mm×2mm大小長條形。因為固定劑的滲透能力較弱，組織塊如果太大，塊的內(nèi)部將不能得到良好的固定。
(3)機械損傷要小，解剖器械應鋒利，操作宜輕，避免牽拉、挫傷與擠壓。
(4)操作在低溫(0℃～4℃)下進行，以降低酶的活性，防止細胞自溶。
(5)取材部位要準確
1.2取材方法：
將取出的組織放在潔凈的韌性較大的紙上，滴一滴預冷的固定液，用新的、鋒利的刀片成“拉鋸式”將組織切下并修小，然后用牙簽或鑷子將組織塊移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果組織帶有較多的血液和組織液，應先用固定液洗幾遍，然后再切成小塊固定。
2固定
2.1固定的目的
是盡可能使細胞中的各種細胞器以及大分子結構保持生活狀態(tài)，并且牢固地固定在它們原來所在的位置上。
2.2固定的方法
有物理法和化學法兩大類。
物理法系采用冰凍、干燥等手段來保持細胞結構；
化學法是用一定的化學試劑來固定細胞結構?，F(xiàn)通常使用化學法對組織或細胞進行固定。
2.3常用固定劑有:
(1)(OsO4)
是一種強氧化劑，與氮原子有較強的親和力，因而對于細胞結構中的蛋白質(zhì)成分有良好的固定作用。它還能與不飽和脂肪酸反應使脂肪得以固定。此外，還能固定脂蛋白，使生物膜結構的主要成分磷脂蛋白穩(wěn)定。它還能與變性DNA以及核蛋白反應，但不能固定天然DNA、RNA及糖原。固定劑有強烈的電子染色作用，用它固定的樣品圖象反差較好。鋨固定的時間一般為1-2小時。
(2)戊二醛 (C5H8O2)
戊二醛的優(yōu)點是對糖原、糖蛋白、微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞基質(zhì)等有較好的固定作用，對組織和細胞的穿透力比強，還能保存某些酶的活力，長時間的固定(幾周甚至1～2個月)不會使組織變脆。缺點是不能保存脂肪，沒有電子染色作用，對細胞膜的顯示較差。
組織塊固定常規(guī)采用戊二醛—鋨酸雙重固定法。分前固定和后固定，中間用磷酸緩沖液漂洗。前固定用2.5%戊二醛固定2小時以上、后固定用1%鋨酸固定液固定1～
2小時，pH7.2～7.4。固定完畢，用緩沖液漂洗20分鐘后進行脫水。
3脫水
為了保證包埋介質(zhì)*滲入組織內(nèi)部，必須事先將組織內(nèi)的水分驅除干凈，即用一種和水及包埋劑均能相混溶的液體來取代水，常用的脫水劑是乙醇和丙酮。
急驟的脫水會引起細胞的收縮，因此，脫水應梯度進行：15% 乙醇15分鐘，30%乙醇15分鐘，50%乙醇15分鐘， 70%
乙醇15分鐘，85%乙醇15分鐘，95%乙醇15分鐘，99%乙醇10分鐘(二次)。游離細胞可適當縮短脫水時間。過度脫水不僅引起更多物質(zhì)的抽提，而且會使樣品發(fā)脆，造成切片困難。
4滲透和包埋
4.1滲透
滲透就是利用包埋劑滲入到組織內(nèi)部取代脫水劑的過程，這種包埋劑在單體狀態(tài)時(聚合前)為液體，能夠滲入組織內(nèi)，當加入某些催化劑，并經(jīng)加溫后，能聚合成固體，以便進行超薄切片。
目前常用的包埋劑是環(huán)氧樹脂(epoxyresin)。環(huán)氧樹脂是一類高分子聚合物，它的分子中含有兩種反應基團，即環(huán)氧基和羥基。當加入酸酐類時，樹脂分子中的羥基能與酸酐結合，形成分子間的橫橋連接，這種起橫橋式連接作用的交聯(lián)劑叫做硬化劑，它們參與交聯(lián)反應，并被吸收到樹脂鏈中。常用的硬化劑有十二烷基琥珀酸酐(或叫十二碳烯基丁二酸酐，簡稱DDSA)、甲基內(nèi)次甲基鄰苯二甲酸酐(或叫六甲酸酐，簡稱MNA)及順丁烯二酸酐等。
當加入胺類時，就引起末端環(huán)氧基相連，形成首尾相接的長鏈狀聚合物。這種促進末端相接的交聯(lián)劑叫做催化劑或加速劑。常用的加速劑有2,4,6-三(二甲氨基酚)(簡稱DMP(30)、二乙基苯胺及乙二胺等。為了改善包埋塊的切割性能，某些環(huán)氧樹脂包埋劑配方中還加有增塑劑，使包埋塊具有適當?shù)捻g性。常用的增塑劑為鄰苯二甲酸二丁酯(簡稱DBP)。
4.2包埋
包埋操作：常規(guī)將組織塊包埋在多孔橡膠包埋模板中，然后置烤箱烘干，在45℃(12小時)、60℃(24-36小時)烤箱內(nèi)加溫，即可聚合硬化，形成包埋塊。
包埋操作中應注意以下幾點：
(1)所有試劑要防潮，存放在干燥器中；
(2)所用器皿應烘干；
(3)配包埋劑時，每加入一種試劑要攪拌均勻；
(4)包埋時動作要輕巧，防止產(chǎn)生氣泡；
(5)皮膚盡量不要接觸包埋劑，以免引起皮炎；
(6)盛放過包埋劑的容器要及時用丙酮清洗干凈。
5超薄切片
5.1修塊
一般用手工對包埋塊進行修整。將包埋塊夾在特制的修塊器上或拿在手中，在明亮處或放在解剖鏡下，用什錦銼或鋒利的刀片先銼或削去表面的包埋劑，露出組織，然后在組織的四周以和水平面成45度的角度削去包埋劑，修成錐體形。
5.2半薄切片定位
利用超薄切片機切厚度為1μm-10μm的切片，稱厚切片或半薄切片。將切下的片子用鑷子或吸管轉移到干凈的事先滴有蒸餾水的載玻片上，加溫，使切片展平，干燥后經(jīng)甲苯胺藍染色，光學顯微鏡觀察定位。
半薄切片進行光學顯微鏡觀察的目的：(微生物顯微鏡)
(1)定位：通過光學顯微鏡觀察，確定所要觀察的范圍，然后保留要用電鏡觀察的部分，修去其余部分。
(2)便于對同一組織的同一部位進行光學顯微鏡和電鏡的對比觀察。半薄切片定位以后，要對包埋塊作進一步的修整。通常將塊的頂端修成金字塔形，頂面修成梯形或長方形，每邊的長度為0.2mm～0.3mm。
5.3制刀超薄切片使用的刀有兩種：一種是玻璃刀，另一種是鉆石刀。由于玻璃刀價格便宜，使用者較多。制刀用的玻璃為硬質(zhì)玻璃，厚度為5mm～6.5mm。
玻璃刀用制刀機制作。制好玻璃刀后，要圍繞刀口制作一只水槽，以便使超薄切片漂浮在水面上。水槽有塑料水槽和膠布水槽兩種。塑料水槽有固定的形狀，可反復使用。膠布水槽是臨時用膠布或專用塑料條制作的。裝好水槽后，用熔化的石蠟封固接口，防止漏水。
5.4載網(wǎng)和支持膜.(1) 載網(wǎng)
電鏡中使用的載網(wǎng)有銅網(wǎng)、不銹鋼網(wǎng)、鎳網(wǎng)等，一般常用銅網(wǎng)。載網(wǎng)為圓形，直徑3mm。網(wǎng)孔的形狀有圓形、方形、單孔形等。網(wǎng)孔的數(shù)目不等，有100、200、300目等多種規(guī)格，可根據(jù)需要進行選擇。
(2)支持膜的制備
挑選并清洗好載網(wǎng)之后，要在載網(wǎng)上覆蓋一層薄膜，這層薄膜稱支持膜，厚度為10nm～20nm。對支持膜的要求是透明無結構，并能承受電子束的轟擊。常用的支持膜有火棉膠膜及縮甲醛膜(formvar膜)，一般采用后者。
5.5超薄切片機
超薄切片需用超薄切片機進行。
5.5.1超薄切片機分類
根據(jù)推進原理不同，將超薄切片機分為兩大類：
(1)機械推進式切片機，用微動螺旋和微動杠桿來提供微小推進；
(2)熱脹冷縮式切片機，利用金屬桿熱脹或冷縮時產(chǎn)生的微小長度變化來提供推進。
5.5.2超薄切片的步驟包括：(金相顯微鏡)
(1)安裝包埋塊；
(2)安裝玻璃刀；
(3)調(diào)節(jié)刀與組織塊的距離；
(4)預切片；
(5)換切片刀重新調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)刀與組織塊的距離；
(6)水槽液面高度與燈光位置；
(7)調(diào)節(jié)切片厚度及切片速度，切片；
(8)將切片撈在有支持膜的載網(wǎng)上。
5.5.3超薄切片厚度的判斷
干涉色厚度
暗灰色<40nm
灰色40nm～50nm
銀色50nm～70nm
金色70nm～90nm
紫色80nm～150nm
6超薄切片的染色
未經(jīng)染色的超薄切片，反差很弱。因此，要進行染色處理，以增強樣品的反差。
一般是用重金屬鹽與組織細胞中某些成分結合或被組織吸附來達到染色的目的。重金屬的原子對電子束形成散射，從而提高圖象的反差。
常用的染色劑有醋酸鈾和檸檬酸鉛。染色方法有兩種：
(1)組織塊染色
在脫水至70%乙醇時，將組織塊放在用70%乙醇配制的飽和醋酸鈾溶液中，染色時間2小時以上，或在冰箱中過夜。
(2)切片染色(生物顯微鏡)
預先取一個清潔的培養(yǎng)皿，將石蠟溶解制作成蠟板，然后滴數(shù)滴染液于蠟板上，用鑷子夾住載網(wǎng)的邊緣，把貼有切片的一面朝下，使載網(wǎng)浮在液滴上，蓋上培養(yǎng)皿，染色10～20分鐘。載網(wǎng)從染液中取出后，必須盡快用蒸餾水清洗干凈。
在染色過程中，鉛染液容易與空氣中的二氧化碳結合形成碳酸鉛顆粒，而污染切片。因此，在保存和使用染液時，要盡量減少與空氣的接觸。為防止鉛沉淀污染，可在培養(yǎng)皿內(nèi)放置氫氧化鈉顆粒，以吸收空氣中的二氧化碳。
手機版
制藥網(wǎng)手機版
制藥網(wǎng)小程序
官方微信
公眾號：zyzhan
預告 
預告 
預告 
