【技術標準解析】CDE納米藥物質量控制研究技術指導原則解讀（一）

【技術標準解析】CDE納米藥物質量控制研究技術指導原則解讀（一）

#本文由馬爾文帕納科應用專家張鵬博士供稿#

為規(guī)范和指導納米藥物研究與評價，在國家藥品監(jiān)督管理局的部署下，藥審中心組織制定了《納米藥物質量控制研究技術指導原則（試行）》、《納米藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則（試行）》《納米藥物非臨床安全性評價研究技術指導原則（試行）》三項關于納米藥物研究、質控、評價的技術指導原則。并由經國家藥品監(jiān)督管理局審查同意，8月27日予以發(fā)布通告，三項技術指導原則自發(fā)布之日起開始施行。

其中《納米藥物質量控制研究技術指導原則》主要內容是圍繞著納米藥物的安全性、有效性以及質量可控性展開的。在這3方面，質量的可控性顯得尤為重要，它一定程度上決定了藥物的安全性和有效性。

該指導原則進一步將納米藥物細分為三類：藥物納米粒、載體類納米藥物以及其他類納米藥物，前兩類藥物適用于該指導原則。

在研發(fā)過程中，納米藥物的質量控制指標又可以分為納米相關特性和制劑基本特性兩大類。其中納米相關特性是可能與藥物在體內行為息息相關的重要質量指標。又包括例如平均粒徑及其分布、納米粒結構特征、微觀形態(tài)、表面性質（電荷、比表面積等）包封率、載藥量、納米粒濃度、納米粒穩(wěn)定性等等。

質量控制指標涉及方面較多，本文重點關注以下三個方面的指標：

1. 粒徑（平均粒徑及其分布）

2. 表面電荷

3. 納米粒濃度

在粒徑表征方面，該指導意見原文如下：

“應選擇適當的測定方法對納米藥物的粒徑及分布進行研究，并進行完整的方法學驗證及優(yōu)化。粒徑及分布通常采用動態(tài)光散射法（Dynamic light scattering，DLS）進行測定，需要使用經過認證的標準物質（Certified reference material，CRM）進行校驗，測定結果為流體動力學粒徑（Rh），粒徑分布一般采用多分散系數（Polydispersity index，PDI）表示。除此之外，顯微成像技術（如透射電鏡（Transmission electron microscopy，TEM）、掃描電鏡（Scanning electron microscopy，SEM）和原子力顯微鏡（Atomic force microscopy，AFM）、納米顆粒跟蹤分析系統(tǒng)(Nanoparticle tracking analysis, NTA)、小角X射線散射（Small-angle X-ray scattering，SAXS）和小角中子散射（Small-angle neutron scattering，SANS）等也可提供納米藥物粒徑大小的信息。對于非單分散的樣品，可考慮將粒徑測定技術與其它分散/分離技術聯用。”

在了解動態(tài)光散射技術（DLS）之前，我們先來講一講粒徑測量時的“等效球體”的概念。

想象一下，當我們完成顆粒粒徑測試后，該如何用準確的數值來描述這些三維顆粒的大小呢？當顆粒是規(guī)則的形狀時，比如說正方體、球體，我們可以用一個數值，例如：邊長、直徑，來表示這個顆粒的大小；但是，當顆粒呈現的形貌是無規(guī)則的話，我們就無法用一個數值來描述這個顆粒大小了，那有人會說，用一系列數值來描述這些顆粒不就行了嗎，這個方法確實可行，但是隨之帶來了數據呈現的復雜度以及顆粒粒徑大小比較的困難度。這個時候我們就必須引入“等效球體”概念了。

什么叫做等效球體呢？

當我們通過某種技術測量顆粒在某一方面的性質，并得到了一個具體的數值，如果一個剛性球體在該性質方面的數值和前者一樣，那么我們就認為待測物的顆粒大小和這個剛性球的大小一致。

等效球體概念在粒徑上的應用既能滿足準確表示待測顆粒的粒徑大小，又能使得這些數值能夠被用來進行大小比較（單個數值）。

如圖1所示，我們可以得知，當一個不規(guī)則的顆粒采用不同的測量技術（沉降法、電阻法、體積法等等）去進行測量時，往往會得到不同的粒徑值。

而我們說的動態(tài)光散射技術測量的是顆粒的擴散速度，所以，具有同樣大小擴散速度的剛性球體的直徑就是待測顆粒的粒徑大小，我們一般稱之為流體力學直徑。

動態(tài)光散射

接著我們進一步來了解一下什么是DLS技術：

分散在溶液相的納米顆粒由于受到溶劑分子的撞擊，呈現出無規(guī)則的運動，我們稱之為布朗運動（Brownian motion），如果我們將一束激光照射至含有該納米顆粒的溶液中，溶液相中的顆粒會產生散射光，隨后在一定的角度收集相關的散射光，我們就能得到如圖2所示的散射光強隨時間的變化曲線，可以看出大顆粒布朗運動較為緩慢，散射光強的變化頻率較慢（圖2，上）。小顆粒則相反，由于其布朗運動劇烈，接收到的散射光強的變化頻率較快（圖2，下）。

而動態(tài)光散射技術則可以捕獲上述散射光變化的頻率，進而獲得顆粒的布朗運動速率大小，最后通過反演算法獲得顆粒的粒徑和分布。

根據斯托克斯-愛因斯坦方程（Stokes-Einstein）的定義，我們可以看出，顆粒的運動速率是和它的粒徑成反比的，運動速率越快，粒徑越小，運動速率越慢，粒徑越大。

該方程式：DH=KT/3πηD

K：玻爾茲曼常數

T：整個體系的絕對溫度值

η：溶劑粘度值

D：顆粒平動擴散系數

那具體如何獲得顆粒的布朗運動速率(D)呢？

接下來我們要引入“相關性”這個概念，如圖3所示，如果我們將t時刻的散射光強度和其后較長時間的散射光強相比較，顯然，他們沒有什么相關性。但是，當我們將時間縮短到很短時間范圍內，也就是將t和t+δt時刻的光強值進行比較，就能得到很強的相關性，隨著時間的增加（δt, 2δt, 3δt, 等等)，其散射光強值和t時刻的相關性不斷衰減，最后接近0值，相關性通常用數值來描述（1→0），數值越靠近“1”代表相關性非常高，越接近“0”代表相關性很低。δt的時間非常短，一般在納秒（nanosecond，ns）或者微秒（microsecond，μs）。

散射光強在不同時間點的相關性我們用G (τ)來表示：G (τ)=A[1+Bexp (-2Γτ)]

τ代表著信號采集滯后時間

Γ=Dq2，

q=(4πn/λ0) sin(θ/2)，散射矢量

D：顆粒平動擴散系數

n：溶液的折光指數

λ0：入射光波長

θ：散射光接收角度

最后，我們用相關方程來描述這種相關性隨時間的變化（圖4），大顆粒的散射光強的相關性隨時間變化慢，信號衰減慢（左），小顆粒的散射光強的相關性隨時間變化快，信號衰減快（右）。

聊完了DLS的基本原理，我們再來看看大家比較關注的幾個問題：

1. 什么是Z-average size（平均粒徑）、PI（polydispersity index，多分散指數）？

Z-average size表示樣品中顆粒的平均粒徑大小，根據ISO 13321:1996，我們可以知道，該數據是通過累計分析法得到的。

PI代表著樣品的粒徑分布寬度，數值越小，說明體系里的粒徑大小越一致，數值越大，說明體系里的粒徑分布群體越多，粒徑分布較寬，一般我們認為當PI值大于0.7時，表示這個體系不再適合用DLS這種技術進行表征了。

除了平均粒徑和PI，我們還能得到顆粒的光強粒徑分布圖，在這個分布圖里，我們能得到不同粒徑下對應的散射光強占比數據，這些分布圖是根據分布算法得到的。

2. 如何看待不同測量角度下得到的粒徑數據？

市面上主要存在兩種測量角度的納米粒度儀，分別是90°和173°，前者我們稱之為側向角，后者我們稱之為背向角。

當測試的樣品為粒徑窄分布時，例如聚苯乙烯標準樣品，兩種測量角度都能得到很好的粒徑分布圖，結果也非常一致（圖5）。

當測試的樣品為粒徑寬分布時，比如一些生物樣品，兩種測量角度得到的粒徑分布圖就會有區(qū)別（見圖6）。

這是為什么呢？

這其實是和顆粒的散射性質有關系的，當顆粒的粒徑大小小于入射波段的1/10時，顆粒在各個方向上的散射光強度都一樣，我們稱之為各向同性，那么在這兩個角度上進行測量，都能得到正確的數值。但是隨著顆粒粒徑的增加，顆粒在各個方向上的散射光強開始變得不一致，越靠近0度角，其散射光強增加越強烈，我們稱之為各向異性。在絕大多數情況下，不同粒徑的顆粒其散射強度在90°要比在173°要強一些，當體系中大顆粒開始變多時，來自于大顆粒的散射光強貢獻度在90°角下就會比在173°角下要更多，因為粒徑分布的數據是根據不同粒徑的散射光強在整個體系的占比中得到的，所以在90°角下會使得顆粒的粒徑分布更容易傾向于體系中存在的大顆粒。