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動(dòng)物源性食品中新霉素殘留的微生物測(cè)定法

來源:上海源葉生物科技有限公司   2011年02月10日 09:33  

(1)試劑和材料 以下所用的試劑,除特別注明外均為分析純規(guī)定的二級(jí)水。 水為符合GB/T 6682
①新霉素標(biāo)準(zhǔn)品
②磷酸氫二鉀
③磷酸二氫鉀
④氫氧化鈉
⑤蛋白胨 生化試劑
⑥瓊脂 生化試劑
⑦酵母粉 生化試劑
⑧牛肉膏 生化試劑
⑨葡萄糖
⑩氯化鈉
⑾滅菌磷酸鹽緩沖溶液(0.1mol/L,pH 8.o) 準(zhǔn)確稱取16.73g無水磷酸氫二鉀和0.523g無水磷酸二氫鉀,加水溶解并稀釋至1000ml。121~C滅菌20min,備用。
⑿新霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液 準(zhǔn)確稱取適量(不低于20mg)新霉素標(biāo)準(zhǔn)品,加滅菌磷酸鹽緩沖溶液(o.1mol/l pH 8.o)溶解,并稀釋成濃度為100bg/m1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,真空抽濾后,置4~C冰箱中保存有效期4周。
(2)儀器設(shè)備
①平底雙碟 直徑約90mm,高16~17mm
②牛津杯 不銹鋼,高10.0mm,外徑8.0mm內(nèi)徑6.0mm
③游標(biāo)卡尺 度o.02mm
④旋渦混合器
⑤真空泵
⑥離心機(jī)
⑦分光光度計(jì)
⑧恒溫電熱水浴箱
⑨分析天平 感量o.0001g
⑩電熱恒溫培養(yǎng)箱
(3)測(cè)定步驟
①菌懸液的制備 將表皮葡萄球菌26069型在新鮮培養(yǎng)基I上連續(xù)傳代3次后,用適
量0.85%NaCl滅菌溶液沖洗斜面培養(yǎng)物并稀釋成菌懸液。在560nm波長下,菌懸液的光
透過率控制在80%左右。菌懸液應(yīng)新鮮制備。
②雙碟的制備
底層 加10ml融化的培養(yǎng)基I于培養(yǎng)雙碟中,均勻鋪平,在平面上待其凝固。
菌層 在適量預(yù)先融化并維持在48~C的培養(yǎng)基Ⅱ中加入適量(通常o.2~o.5m1)新制備的菌懸液。充分混勻后,在每個(gè)含有底層的培養(yǎng)雙碟中加入4.0mi。將培養(yǎng)雙碟兩邊傾斜并作圓周旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)使培養(yǎng)基均勻分散鋪平,并待其凝固。在使用的當(dāng)天制備雙碟。用標(biāo)準(zhǔn)品參照濃度工作液所得的抑菌圈直徑應(yīng)為(18土2.4)mm。
③標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 用o.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH8.o)稀釋新霉素標(biāo)準(zhǔn)品貯備液成濃度為2.4bg/ml、1.2/Lg/m1、0,6gg/m1、0。3/lg/ml、0.15bg/m1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,以o.6ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液為標(biāo)準(zhǔn)品參照濃度工作液,按微生物瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定各濃度的抑菌圈直徑,在坐標(biāo)紙上繪圖,以各濃度的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo),平均抑菌圈直徑的校正值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
④提取 稱?。?±.05)g試料,置50ml塑料離心管中,加入10mlo.1mol幾磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.O),置旋渦混合器上混合lmin,O~4~C靜置30min,放入100~C水浴加熱5rain,取出冷卻,5000r/mill離心l5min,取上清液用lmol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 8.0后作為試樣溶液,供微生物學(xué)測(cè)定。
⑤測(cè)定 每個(gè)雙碟間隔3個(gè)牛津杯滴加標(biāo)準(zhǔn)品參照濃度工作液,另3個(gè)牛津杯滴加試樣溶液,每一樣品重復(fù)3個(gè)雙碟,32—35~C培養(yǎng)18~20h,量取抑菌圈直徑,由標(biāo)準(zhǔn)曲線求取藥物含量。
⑥空白試驗(yàn) 除不加試料外,采用*相同的測(cè)定步驟進(jìn)行平行操作
(4)靈敏度和回收率
本方法在雞組織中的檢測(cè)限為500ug/kg。
在500ug/kg添加濃度水平上的回收率范圍為80%~110%
 

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