Elisa實(shí)驗(yàn)：酶聯(lián)免疫吸附測定類型與操作步驟

　　酶聯(lián)免疫吸附測定類型與操作步驟

　　雙抗體夾心法檢測抗原

　　雙抗體夾心法是檢測抗原常用的方法，但要注意的是在一步法(待測抗原與酶標(biāo)抗體一起加入反應(yīng))測定中，當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí)，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成“夾心復(fù)合物"出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)時(shí)，應(yīng)注意可測范圍的高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。 雙抗體夾心法測抗原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子(RF)的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動(dòng)物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標(biāo)本中如含有RF，它可充當(dāng)抗原成份，同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽性反應(yīng)。雙抗體夾心法適用于測定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。

　　雙抗體夾心法的簡要操作步驟為：

　　1)先加入抗體，使抗體固定結(jié)合于載體表面;

　　2)再加樣品，使目標(biāo)檢測抗原形成抗原-抗體復(fù)合物;

　　3)加酶標(biāo)抗抗體(第二種動(dòng)物抗抗原的酶標(biāo)抗體);

　　4)加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，顯色的深淺與待測抗原的量成正比。

　　競爭法檢測抗原

　　當(dāng)小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的抗體結(jié)合位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，可以采用競爭法模式。方法的基本原理可見圖2，經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標(biāo)記抗原和被測抗原的混合液，而另一組只加酶標(biāo)記抗原，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為所要測定的未知抗原的量。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。

　　競爭法的簡要操作步驟：

　　1)先加入抗體，使抗體固定結(jié)合于載體表面;

　　2)加入梯度濃度比例的待測樣品與酶標(biāo)抗原混合物,同時(shí)做只加酶標(biāo)抗原的對(duì)照組;

　　3)加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，對(duì)比實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的顯色差異，計(jì)算未知抗原的量。

　　雙抗原夾心法檢測抗體

　　雙抗原夾心法的反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。

　　雙抗原夾心法的簡要操作步驟為：

　　1)先加入抗原，使抗體固定結(jié)合于載體表面;

　　2)再加樣品，使目標(biāo)檢測抗體形成抗原-抗體復(fù)合物;

　　3)加酶標(biāo)抗原;

　　4)加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，顯色的深淺與待測抗體的量成正比。

　　間接法檢測抗體

　　間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體(辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗人免疫球蛋白抗體)以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體(人免疫球蛋白)，故稱為間接法。本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。

　　間接法的簡要操作步驟：

　　1)將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原;

　　2)加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗-體復(fù)合物;

　　3)加酶標(biāo)抗抗體;

　　4)加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，顯色的深淺與待測抗體的量成正比。

　　競爭法檢測抗體

　　競爭法測抗體的反應(yīng)模式與競爭法測抗原類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗體。當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。如抗原為高純度的，可直接包被固相。競爭法測抗體有多種模式，可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競爭結(jié)合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競爭結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)抗體，與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)。抗HBe的檢測一般采用此法。

　　競爭法的簡要操作步驟：

　　1)先加入特異性抗原，使抗原固定結(jié)合于載體表面;

　　2)加入梯度濃度比例的待測樣品與酶標(biāo)抗體混合物，并做只加酶標(biāo)抗體的對(duì)照組;

　　3)加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，對(duì)比實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的顯色差異，計(jì)算未知抗體的量。

　　捕獲包被法檢測抗體

　　捕獲包被法(亦稱反向間接法)ELISA，主要用于血清中某種抗體亞型成分(如IgM)的測定。以目常用的IgM測定為例，因血清中針對(duì)某種抗原的特異性IgM和IgG同時(shí)存在，則后者可干擾IgM的測定。因此先將所有血清IgM(包括異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上，在去除IgG后再測定特異性IgM。IgM抗體的檢測用于傳染病的早期診斷中。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM(其中包括針對(duì)抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM)。然后加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結(jié)合。繼而加酶標(biāo)記針對(duì)抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標(biāo)本中的IgM成正相關(guān)。此法常用于病毒性感染的早期診斷。類風(fēng)濕因子(RF)同樣能干擾捕獲包被法測定IgM抗體，導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。因此中和IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。

　　捕獲法測抗體的簡要操作步驟：

　　1)特異性捕獲抗體的包被，先把能特異性結(jié)合待測抗原的抗體固定于固相載體表面;

　　2)加入待測樣品，通過固定在載體表面的針對(duì)該抗原的抗體固定于載體表面;

　　3)加入特異性抗原以及針對(duì)該特異性抗原的酶標(biāo)抗體;

　　4)加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，顯色的深淺與待測抗體的量成正比。

　　ABS-ELISA法

　　除以上6種ELISA測試方法外，近年在親和素-生物素系統(tǒng)上又發(fā)展出ABS-ELISA法 。親和素是一種糖蛋白，每個(gè)分子由4個(gè)能和生物素結(jié)合的亞基組成，生物素為小分子化合物。用化學(xué)方法制成的衍生物素-羥基琥珀酰亞胺酯可與抗體或酶形成生物素標(biāo)記產(chǎn)物，標(biāo)記方法頗為簡便，并且不影響抗體或酶原有的生物學(xué)活性。親和素生物素系統(tǒng)，簡稱ABS(avidin-biotin system)。由于親和素與生物素間的親和力強(qiáng)，結(jié)合迅速，且其穩(wěn)定，使BAS標(biāo)記技術(shù)比常規(guī)酶聯(lián)免疫、放射免疫及熒光免疫技術(shù)有著更高的靈敏度，為微量抗原、抗體的檢測開辟了新的途徑，大大提高了檢測的靈敏度，但該方法比普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，因此在臨床檢驗(yàn)中ABS-ELISA應(yīng)用不多。ABS-ELISA法可分為酶標(biāo)記親和素-生物素(LAB)法和橋聯(lián)親和素-生物素(ABC)法兩種類型。兩者均以生物素標(biāo)記的抗體(或抗原)代替原ELISA系統(tǒng)中的酶標(biāo)抗體(抗原)。

　　在LAB法中，將特異性抗體生物素化、酶分子標(biāo)記在親和素分子上，生物素化抗體與被檢抗原結(jié)合后，再借BAS的高度親和力將酶分子聯(lián)結(jié)到抗原分子上，經(jīng)酶促反應(yīng)即可檢出抗原，因此提高檢測的敏感度。

　　ABC法同樣將特異性抗體生物素化、酶分子標(biāo)在生物素上，親和素和酶標(biāo)生物素需要先按一定比例形成ABC復(fù)合物，這種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)結(jié)合了大量的酶分子，當(dāng)親和素尚未被酶標(biāo)生物素飽和時(shí)，生物素化抗體即可與之結(jié)合, 使被檢抗原、生物素化抗體和酶標(biāo)生物素聯(lián)成一體。

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