電子顯微鏡

電子顯微鏡是使用電子來展示物件的內部或表面的顯微鏡。高速的電子的波長比可見光的波長短（波粒二象性），而顯微鏡的分辨率受其使用的波長的限制。20世紀70年代，透射式電鏡的分辨率約為0.3納米(人眼的分辨本領約為0.1毫米)。高速的電子的波長比可見光的波長短（波粒二象性），而顯微鏡的分辨率受其使用的波長的限制，因此電子顯微鏡的分辨率（約0.1納米）遠高于光學顯微鏡的分辨率（約200納米），所以通過電鏡就能用肉眼直接觀察到某些重金屬的原子和晶體中排列整齊的原子點陣。技術介紹電子顯微鏡常用的有透射電鏡（transmissionelectronmicroscope，TEM）和掃描電子顯微鏡（scanningelectronmicroscope,SEM）。與光鏡相比電鏡用電子束代替了可見光，用電磁透鏡代替了光學透鏡并使用熒光屏將肉眼不可見電子束成像。與光鏡相比電鏡用電子束代替了可見光，用電磁透鏡代替了光學透鏡并使用熒光屏將肉眼不可見電子束成像。 電子顯微鏡由鏡筒、真空裝置和電源柜三部分組成。鏡筒主要有電子源、電子透鏡、樣品架、熒光屏和探測器等部件，這些部件通常是自上而下地裝配成一個柱體。電子透鏡用來聚焦電子，是電子顯微鏡鏡筒中最重要的部件。一般使用的是磁透鏡，有時也有使用靜電透鏡的。它用一個對稱于鏡筒軸線的空間電場或磁場使電子軌跡向軸線彎曲形成聚焦，其作用與光學顯微鏡中的光學透鏡（凸透鏡）使光束聚焦的作用是一樣的，所以稱為電子透鏡。光學透鏡的焦點是固定的，而電子透鏡的焦點可以被調節(jié)，因此電子顯微鏡不像光學顯微鏡那樣有可以移動的透鏡系統(tǒng)?，F代電子顯微鏡大多采用電磁透鏡，由很穩(wěn)定的直流勵磁電流通過帶極靴的線圈產生的強磁場使電子聚焦。電子源是一個釋放自由電子的陰極，柵極，一個環(huán)狀加速電子的陽極構成的。陰極和陽極之間的電壓差必須非常高，一般在數千伏到3百萬伏特之間。它能發(fā)射并形成速度均勻的電子束，所以加速電壓的穩(wěn)定度要求不低于萬分之一。 樣品可以穩(wěn)定地放在樣品架上，此外往往還有可以用來改變樣品（如移動、轉動、加熱、降溫、拉長等）的裝置。探測器用來收集電子的信號或次級信號。真空裝置用以保障顯微鏡內的真空狀態(tài)，這樣電子在其路徑上不會被吸收或偏向，由機械真空泵、擴散泵和真空閥門等構成，并通過抽氣管道與鏡筒相聯接。電源柜由高壓發(fā)生器、勵磁電流穩(wěn)流器和各種調節(jié)控制單元組成。 電子顯微鏡按結構和用途可分為透射式電子顯微鏡、掃描式電子顯微鏡、反射式電子顯微鏡和發(fā)射式電子顯微鏡等。透射式電子顯微鏡常用于觀察那些用普通顯微鏡所不能分辨的細微物質結構；掃描式電子顯微鏡主要用于觀察固體表面的形貌，也能與X射線衍射儀或電子能譜儀相結合，構成電子微探針，用于物質成分分析；發(fā)射式電子顯微鏡用于自發(fā)射電子表面的研究。

因電子束穿透樣品后，再用電子透鏡成像放大而得名。它的光路與光學顯微鏡相仿，可以直接獲得一個樣本的投影。通過改變物鏡的透鏡系統(tǒng)人們可以直接放大物鏡的焦點的像。由此人們可以獲得電子衍射像。使用這個像可以分析樣本的晶體結構。在這種電子顯微鏡中，圖像細節(jié)的對比度是由樣品的原子對電子束的散射形成的。由于電子需要穿過樣本，因此樣本必須非常薄。組成樣本的原子的原子量、加速電子的電壓和所希望獲得的分辨率決定樣本的厚度。樣本的厚度可以從數納米到數微米不等。原子量越高、電壓越低，樣本就必須越薄。樣品較薄或密度較低的部分，電子束散射較少，這樣就有較多的電子通過物鏡光欄，參與成像，在圖像中顯得較亮。反之，樣品中較厚或較密的部分，在圖像中則顯得較暗。如果樣品太厚或過密，則像的對比度就會惡化，甚至會因吸收電子束的能量而被損傷或破壞。透射電鏡的分辨率為0.1～0.2nm，放大倍數為幾萬～幾十萬倍。由于電子易散射或被物體吸收，故穿透力低，必須制備更薄的超薄切片（通常為50～100nm）。透射式電子顯微鏡鏡筒的頂部是電子槍，電子由鎢絲熱陰極發(fā)射出、通過，第二兩個聚光鏡使電子束聚焦。電子束通過樣品后由物鏡成像于中間鏡上，再通過中間鏡和投影鏡逐級放大，成像于熒光屏或照相干版上。中間鏡主要通過對勵磁電流的調節(jié)，放大倍數可從幾十倍連續(xù)地變化到幾十萬倍；改變中間鏡的焦距，即可在同一樣品的微小部位上得到電子顯微像和電子衍射圖像。

掃描電子顯微鏡的電子束不穿過樣品，僅以電子束盡量聚焦在樣本的一小塊地方，然后一行一行地掃描樣本。入射的電子導致樣本表面被激發(fā)出次級電子。顯微鏡觀察的是這些每個點散射出來的電子，放在樣品旁的閃爍晶體接收這些次級電子，通過放大后調制顯像管的電子束強度，從而改變顯像管熒光屏上的亮度。圖像為立體形象，反映了標本的表面結構。顯像管的偏轉線圈與樣品表面上的電子束保持同步掃描，這樣顯像管的熒光屏就顯示出樣品表面的形貌圖像，這與工業(yè)電視機的工作原理相類似。由于這樣的顯微鏡中電子不必透射樣本，因此其電子加速的電壓不必非常高。掃描式電子顯微鏡的分辨率主要決定于樣品表面上電子束的直徑。放大倍數是顯像管上掃描幅度與樣品上掃描幅度之比，可從幾十倍連續(xù)地變化到幾十萬倍。掃描式電子顯微鏡不需要很薄的樣品；圖像有很強的立體感；能利用電子束與物質相互作用而產生的次級電子、吸收電子和X射線等信息分析物質成分。掃描電子顯微鏡的制造是依據電子與物質的相互作用。當一束高能的入射電子轟擊物質表面時，被激發(fā)的區(qū)域將產生二次電子、俄歇電子、特征x射線和連續(xù)譜X射線、背散射電子、透射電子，以及在可見、紫外、紅外光區(qū)域產生的電磁輻射。同時，也可產生電子-空穴對、晶格振動（聲子）、電子振蕩（等離子體）。

一般來講的數碼顯微鏡嚴格來說應該屬于光學顯微鏡的范疇。數碼顯微鏡是將精銳的光學顯微鏡技術、*的光電轉換技術、液晶屏幕技術地結合在一起而開發(fā)研制成功的一項高科技產品。從而，我們可以對微觀領域的研究從傳統(tǒng)的普通的雙眼觀察到通過顯示器上再現，從而提高了工作效率。數碼顯微鏡根據數據顯示方式不同可分為兩大類：自帶屏幕數碼顯微鏡和采用計算機顯示的數碼顯微鏡。自帶屏幕數碼顯微鏡，又可分為三類，1.臺式數碼顯微鏡；2.便攜式數碼顯微鏡；3.無線數碼顯微鏡；臺式數碼顯微鏡的主要特點是放大倍率相對較高，可以與電子顯微鏡媲美；便攜式數碼顯微鏡追求的是隨處可顯微，講究小巧。

分辨能力是電子顯微鏡的重要指標，電子顯微鏡的分辨能力以它所能分辨的相鄰兩點的最小間距來表示，即稱為該儀器的點分辨率：d=δ。顯然，分辨率越高，即d的數值（為長度單位）愈小，則儀器所能分清被觀察物體的細節(jié)也就愈多愈豐富，也就是說這臺儀器的分辨能力或分辨本領越強。分辨率與透過樣品的電子束入射錐角和波長有關?？梢姽獾牟ㄩL約為300～700納米，而電子束的波長與加速電壓有關。依據波粒二象性原理，高速的電子的波長比可見光的波長短，而顯微鏡的分辨率受其使用的波長的限制，因此電子顯微鏡的分辨率（0.2納米）遠高于光學顯微鏡的分辨率（200納米）。當加速電壓為50～100千伏時，電子束波長約為0.0053～0.0037納米。由于電子束的波長遠遠小于可見光的波長，所以即使電子束的錐角僅為光學顯微鏡的1%，電子顯微鏡的分辨本領仍遠遠優(yōu)于光學顯微鏡。光學顯微鏡的放大倍率約為2000倍，而現代電子顯微鏡放大倍率超過300萬倍，所以通過電子顯微鏡就能直接觀察到某些重金屬的原子和晶體中排列整齊的原子點陣。
單就放大率（magnification）而言，是指被觀察物體經電子顯微鏡放大后，在同一方向上像的長度與物體實際長度的比值。這是兩條直線的比值，有人將放大率理解為像與物的面積比，這是一種誤解，勢必引起概念上的混淆和計算方法與結果上的混亂。 1.在電子顯微鏡中樣本必須在真空中觀察，因此無法觀察活樣本。隨著技術的進步，環(huán)境掃描電鏡將逐漸實現直接對活樣本的觀察；
2.在處理樣本時可能會產生樣本本來沒有的結構，這加劇了此后分析圖像的難度；
3.由于電子散射能力，容易發(fā)生二次衍射等；
4.由于為三維物體的二維平面投影像，有時像不；
5.由于透射電子顯微鏡只能觀察非常薄的樣本，而有可能物質表面的結構與物質內部的結構不同；
6.超薄樣品（100納米以下），制樣過程復雜、困難，制樣有損傷；
7.電子束可能通過碰撞和加熱破壞樣本；
8.此外電子顯微鏡購買和維護的價格都比較高。
因此，透射電子顯微鏡突破了光學顯微鏡分辨率低的限制，成為了診斷疑難腫瘤的一種新的工具。有研究報道，無色素性腫瘤、嗜酸細胞瘤、肌原性腫瘤、軟組織腺泡狀肉瘤及神經內分泌腫瘤這些在光鏡很難明確診斷的腫瘤，利用電鏡可以明確診斷電鏡主要是通過對超微結構的精細觀察，尋找組織細胞的分化標記，確診和鑒別相應的腫瘤類型。細胞凋亡與腫瘤有著密切的關系，電鏡對細胞凋亡的研究起著重要的作用，因此利用電鏡觀察細胞的超微結構病理變化和細胞凋亡情況，將為腫瘤的診斷和治療提供科學依據。
透射電子顯微鏡觀察的是組織細胞、生物大分子、病毒、細菌等結構，能夠觀察到不同病的病理結構，也可以鑒別一些腫瘤疾病，有研究報道電子顯微鏡技術通過超微結構觀察可以區(qū)分癌、黑色素瘤和肉瘤以及腺癌和間皮瘤；可區(qū)別胸腺瘤、胸腺類癌、惡性淋巴瘤和生殖細胞瘤；可區(qū)別神經母細胞瘤、胚胎性橫紋肌瘤、Ewing氏肉瘤、惡性淋巴瘤和小細胞癌；可區(qū)別纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、平滑肌肉瘤和惡性神經鞘瘤以及區(qū)別梭形細胞癌和癌肉瘤。
在使用透視電子顯微鏡觀察生物樣品前樣品必須被預先處理。隨不同研究要求的需要科學家使用不同的處理方法。
固定：為了盡量保存樣本的原樣使用戊二醛來硬化樣本和使用鋨酸來染色脂肪。
冷固定：將樣本放在液態(tài)的乙烷中速凍，這樣水不會結晶，而形成非晶體的冰。這樣保存的樣品損壞比較小，但圖像的對比度非常低。
脫干：使用乙醇和丙酮來取代水。
墊入：樣本被墊入后可以分割。
分割：將樣本使用金剛石刃切成薄片。
染色：重的原子如鉛或鈾比輕的原子散射電子的能力高，因此可被用來提高對比度。使用透視電子顯微鏡觀察金屬前樣本要被切成非常薄的薄片（約0.1毫米），然后使用電解擦亮繼續(xù)使得金屬變薄，最后在樣本中心往往形成一個洞，電子可以在這個洞附近穿過那里非常薄的金屬。無法使用電解擦亮的金屬或不導電或導電性能不好的物質如硅等一般首先被用機械方式磨薄后使用離子打擊的方法繼續(xù)加工。為防止不導電的樣品在掃描電子顯微鏡中積累靜電它們的表面必須覆蓋一層導電層。[1]

透射式電子顯微鏡常用于觀察那些用普通顯微鏡所不能分辨的細微物質結構；掃描式電子顯微鏡主要用于觀察固體表面的形貌，也能與X射線衍射儀或電子能譜儀相結合，構成電子微探針，用于物質成分分析；發(fā)射式電子顯微鏡用于自發(fā)射電子表面的研究。數碼電子顯鏡用于觀察物體表面，它將實物的圖像放大后顯示在計算機的屏幕上，可以將圖片保存，放大，打印。配測量軟件可以測量各種數據。 

1931年厄恩斯特·盧斯卡和馬克斯·克諾爾研制了臺透視電子顯微鏡。展示這臺顯微鏡時使用的還不是透視的樣本，而是一個金屬格。1986年為此獲得。1938年他在西門子公司研制了臺商業(yè)電子顯微鏡。

1934年鋨酸被提議用來加強圖像的對比度。1937年臺掃描透射電子顯微鏡推出。

一開始研制電子顯微鏡最主要的目的是顯示在光學顯微鏡中無法分辨的如等。1949年可投射的薄片出現后材料學對電子顯微鏡的興趣大增。

1960年代投射電子顯微鏡的加速電壓越來越高來透視越來越厚的物質。這個時期電子顯微鏡達到了可以分辨原子的能力。

1980年代人們能夠使用掃描電子顯微鏡觀察濕樣本。1990年代中越來越多地用來的圖像，同時使用電腦也可以控制越來越復雜的透鏡系統(tǒng)，同時電子顯微鏡的操作越來越簡單。

透射電鏡是以透過樣品經過聚焦與放大后所產生的物像，投射到熒光屏上或照相底片上進行觀察。透射電鏡是以電子束透過樣品經過聚焦與放大后所產生的物像，投射到上或照相底片上進行觀察。透射電鏡的分辨率為0.1～0.2nm，放大倍數為幾萬～幾十萬倍。透射電鏡的為0.1～0.2nm，放大倍數為幾萬～幾十萬倍。由於電子易散射或被物體吸收，故穿透力低，必須制備更薄的超薄切片（通常為50～100nm）。由于電子易散射或被物體吸收，故穿透力低，必須制備更薄的超薄切片（通常為50～100nm）。其制備過程與石蠟切片相似，但要求極嚴格。其制備過程與石蠟切片相似，但要求極嚴格。要在機體死亡后的數分鐘釣取材，組織塊要小(1立方毫米以內），常用戊二醛和進行雙重固定包埋,用特制的超薄切片機（ultramicrotome）切成超薄切片，再經醋酸鈾和檸檬酸鉛等進行電子染色。要在機體死亡后的數分鐘釣取材，組織塊要小(1立方毫米以內），常用戊二醛和餓酸進行雙重固定樹脂包埋,用特制的超薄切片機（ultramicrotome）切成超薄切片，再經醋酸鈾和檸檬酸鉛等進行電子染色。電子束投射到樣品時，可隨組織構成成分的密度不同而發(fā)生相應的電子發(fā)射，如電子束投射到質量大的結構時，電子被散射的多，因此投射到熒光屏上的電子少而呈暗像，電子照片上則呈黑色。電子束投射到樣品時，可隨組織構成成分的密度不同而發(fā)生相應的電子發(fā)射，如電子束投射到質量大的結構時，電子被散射的多，因此投射到熒光屏上的電子少而呈暗像，電子照片上則呈黑色。稱電子密度高（electrondense）。稱電子密度高（electrondense）。反之，則稱為電子密度低（electronlucent）。反之，則稱為電子密度低（electronlucent）。 掃描電鏡是用極細的電子束在樣品表面掃描，將產生的二次電子用特制的探測器收集，形成電信號運送到顯像管，在熒光屏上顯示物體。掃描電鏡是用極細的電子束在樣品表面掃描，將產生的二次電子用特制的探測器收集，形成電信號運送到顯像管，在熒光屏上顯示物體。（細胞、組織）表面的立體構像，可攝制成照片。（細胞、組織）表面的立體構像，可攝制成。掃描電鏡樣品用戊二醛和餓酸等固定，經脫水和后,再於樣品表面噴鍍薄層金膜，以增加二波電子數。掃描電鏡樣品用戊二醛和餓酸等固定，經脫水和臨界點干燥后,再于樣品表面噴鍍薄層金膜，以增加二波電子數。掃描電鏡能觀察較大的組織表面結構，由於它的景深長，1mm左右的凹凸不平面能清所成像，故放樣品圖像富有立體感。掃描電鏡能觀察較大的組織表面結構，由于它的景深長，1mm左右的凹凸不平面能清所成像，故放樣品圖像富有立體感。 1、光學顯微鏡以為介質，電子顯微鏡為電子束為介質，由於電子束波長遠較可見光小，故電子顯微鏡解析度遠比光學顯微鏡高。光學顯微鏡以可見光為介質，電子顯微鏡為電子束為介質，由于電子束波長遠較可見光小，故電子顯微鏡解析度遠比光學顯微鏡高。光學顯微鏡放大倍率只有約1500倍，掃描式顯微鏡可放大到10000倍以上。光學顯微鏡放大倍率只有約1500倍，掃描式顯微鏡可放大到10000倍以上。

2.根據deBroglie，電子的僅與加速電壓有關：根據deBroglie波動理論，電子的波長僅與加速電壓有關：λe＝h/mv＝h/(2qmV)1/2＝12.2/(V)1/2(?)λe＝h/mv＝h/(2qmV)1/2＝12.2/(V)1/2(?)在10KV的加速電壓之下，電子的波長僅為0.12?，遠低於可見光的4000-7000?，所以電子顯微鏡解析度自然比顯微鏡*許多，但是掃描式電子顯微鏡的電子束直徑大多在50-100?之間，與的彈性散射(ElasticScattering)與非彈性散射(InelasticScattering)的反應體積又會比原有的電子束直徑增大，因此一般穿透式電子顯微鏡的解析度比掃描式電子顯微鏡高。在10KV的加速電壓之下，電子的波長僅為0.12?，遠低于可見光的4000-7000?，所以電子顯微鏡解析度自然比光學顯微鏡*許多，但是掃描式電子顯微鏡的電子束直徑大多在50-100?之間，電子與原子核的彈性散射(ElasticScattering)與非彈性散射(InelasticScattering)的反應體積又會比原有的電子束直徑增大，因此一般穿透式電子顯微鏡的解析度比掃描式電子顯微鏡高。

3.掃描式顯微鏡有一重要特色是具有超大的景深（depthoffield），約為光學顯微鏡的300倍，使得掃描式顯微鏡比光學顯微鏡更這合觀察表面起伏程度較大的試片。掃描式顯微鏡有一重要特色是具有超大的景深(depthoffield)，約為光學顯微鏡的300倍，使得掃描式顯微鏡比光學顯微鏡更適合觀察表面起伏程度較大的試片。

4.掃描式電子顯微鏡，其系統(tǒng)設計由上而下，由電子槍(ElectronGun)發(fā)射電子束，經過一組磁透鏡聚焦(CondenserLens)聚焦后，用遮蔽孔徑(CondenserAperture)選擇電子束的尺寸(BeamSize)后，通過一組控制電子束的掃描線圈，再透過物鏡（ObjectiveLens）聚焦，打在試片上，在試片的上側裝有訊號接收器，用以擇取二次電子(SecondaryElectron)或背向散射電子(BackscatteredElectron)成像。掃描式電子顯微鏡，其系統(tǒng)設計由上而下，由電子槍(ElectronGun)發(fā)射電子束，經過一組磁透鏡聚焦(CondenserLens)聚焦后，用遮蔽孔徑(CondenserAperture)選擇電子束的尺寸(BeamSize)后，通過一組控制電子束的掃描線圈，再透過物鏡(ObjectiveLens)聚焦，打在試片上，在試片的上側裝有訊號接收器，用以擇取二次電子(SecondaryElectron)或背向散射電子(BackscatteredElectron)成像。

5.電子槍的必要特性是亮度要高、電子能量散佈(EnergySpread)要小，目前常用的種類計有三種，(W)燈絲、六硼化鑭(LaB6)燈絲、場發(fā)射(FieldEmission)，不同的燈絲在電子源大小、電流量、電流穩(wěn)定度及電子源壽命等均有差異。電子槍的必要特性是亮度要高、電子散布(EnergySpread)要小，目前常用的種類計有三種，鎢(W)燈絲、六硼化鑭(LaB6)、場發(fā)射(FieldEmission)，不同的燈絲在電子源大小、電流量、電流穩(wěn)定度及電子源壽命等均有差異。

分辨能力是電子顯微鏡的重要指標，電子顯微鏡的分辨能力以它所能分辨的相鄰兩點的最小間距來表示，它與透過樣品的電子束入射錐角和波長有關。可見光的波長約為300～700納米，而電子束的波長與加速電壓有關。依據波粒二象性原理，高速的電子的波長比可見光的波長短，而顯微鏡的分辨率受其使用的波長的限制，因此電子顯微鏡的分辨率（約0.2納米）遠高于光學顯微鏡的分辨率（約200納米）。當加速電壓為50～100千伏時，電子束波長約為0.0053～0.0037納米。由于電子束的波長遠遠小于可見光的波長，所以即使電子束的錐角僅為光學顯微鏡的1％，電子顯微鏡的分辨本領仍遠遠優(yōu)于光學顯微鏡。光學顯微鏡的放大倍率約為2000倍，而現代電子顯微鏡放大倍率超過300萬倍，所以通過電子顯微鏡就能直接觀察到某些重金屬的原子和晶體中排列整齊的原子點陣。電子顯微鏡的分辨本領雖已遠勝于光學顯微鏡，但電子顯微鏡因需在真空條件下工作，所以很難觀察活的生物，而且電子束的照射也會使生物樣品受到輻照損傷。其他的問題，如電子槍亮度和電子透鏡質量的提高等問題也有待繼續(xù)研究。