我公司現(xiàn)有專門(mén)檢測(cè)三聚氰胺混合型陽(yáng)離子固相萃取小柱
60mg/3mL 50個(gè)/包
附
三聚氰胺的樣品前處理及LC-MS檢測(cè)方法
三聚氰胺的樣品前處理及檢測(cè)方法
摘 要 三聚氰胺是一種重要的化工材料，常用于制造三聚氰胺樹(shù)脂，是建筑業(yè)中常用的防火材料，本來(lái)與食品、飼料行業(yè)毫不相干，但是發(fā)生在美國(guó)的數(shù)起飼料致死寵物的事件使兩者在一起。經(jīng)過(guò)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)這些進(jìn)口飼料中含有一定濃度的三聚氰胺，對(duì)此，美國(guó)食品（FDA）要求飼料廠商提供三聚氰胺的檢測(cè)報(bào)告，因此，三聚氰胺事件也使得分析領(lǐng)域掀起了檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)熱潮。
關(guān)鍵詞 三聚氰胺， 樣品前處理，LC-MS
1 前言
三聚氰胺事件變成社會(huì)熱點(diǎn)話題是在07年3月份，美國(guó)大量召回被三聚氰胺污染的寵物飼料，起因于寵物飼料致死貓狗的事件。據(jù)不統(tǒng)計(jì)，北美地區(qū)僅美國(guó)因食用有毒飼料而死亡的寵物就有上萬(wàn)只, 相關(guān)投訴不計(jì)其數(shù)，美國(guó)食品藥品管理局調(diào)查顯示，在回收的寵物食品、 死亡動(dòng)物的尿液結(jié)晶和腎臟細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)有三聚氰胺，研究人員還發(fā)現(xiàn), 回收寵物食品所用的小麥谷蛋白添加物中有較高濃度的三聚氰胺存在。盡管國(guó)內(nèi)尚無(wú)動(dòng)物中毒死亡或產(chǎn)生不良反應(yīng)的報(bào)道，對(duì)于三聚氰胺的毒性也有些爭(zhēng)議，但三聚氰胺不是飼料原料，也不是國(guó)家允許使用的飼料添加物。某些不法廠商添加三聚氰胺主要是為了增加產(chǎn)品的表觀蛋白質(zhì)含量，三聚氰胺被廣泛的添加到淀粉、谷朊粉、蛋白FEN 中，致使不僅是飼料生產(chǎn)商，其它的食品工廠也需要三聚氰胺的檢測(cè)以保證他們產(chǎn)品的安全。
本文采用固相萃取法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，并對(duì)比了不同的檢測(cè)方法,包括FDA公布的檢測(cè)方法〔1〕對(duì)三聚氰胺分析的影響。
三聚氰胺（melamine）簡(jiǎn)稱三胺, 學(xué)名三氨三嗪, 別名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，分子式：C3N6H6、 C3N3（NH2）3 。分子量：126.12，是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料〔2〕。三聚氰胺顯弱堿性，能夠與各種酸反應(yīng)生成三聚氰胺鹽。在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿液中，三聚氰胺發(fā)生水解，胺基逐步被羥基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸。三聚氰胺與醛類反應(yīng)生成加成化合物。三聚氰胺與醛反應(yīng)制成樹(shù)脂，三聚氰胺樹(shù)脂是一種多種用途的材料，防火耐熱且有很高的穩(wěn)定性，用于生產(chǎn)塑料、廚房用具、防火纖維、商業(yè)濾膜、膠水和阻燃劑，部分亞洲國(guó)家，也被用來(lái)制造化肥。
2 材料與試劑
2.1 儀器與條件
Agilent 1100高效液相色譜儀（美國(guó)，Agilent公司）；二極管陣列檢測(cè)器（DAD），檢測(cè)波長(zhǎng)240nm，柱溫：40℃。
（1）Agela VenusilTM ASB C18（ 4.6×250mm）；緩沖液：10mM檸檬酸, 10mM庚烷磺酸鈉； 流動(dòng)相：緩沖溶液:乙腈=85:15；流速：1.0mL/min。
（2）Agela VenusilTM ASB C8（ 4.6×250mm）；流動(dòng)相：緩沖液：乙腈=85：15；緩沖液：10mM檸檬酸，10mM辛烷磺酸鈉，調(diào)pH為3.0；流速：1.0mL/min；
離子交換固相萃取柱Agela ClearnertTM PCX
2.2 試劑與樣品
寵物飼料樣品（飼料供應(yīng)中心提供）；甲醇、乙腈為北京艾杰爾科技有限公司提供；氨水、乙酸鉛、三氯YI SUAN、均購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品、檸檬酸、辛烷磺酸鈉（Sigma公司）；甲醇為色譜純，其他均為化學(xué)純。
寵物飼料樣品（飼料供應(yīng)中心提供）；甲醇、乙腈為北京艾杰爾科技有限公司提供；氨水、乙酸鉛、三氯YI SUAN、均購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品、檸檬酸、辛烷磺酸鈉（Sigma公司）；甲醇為色譜純，其他均為化學(xué)純。
3 實(shí)驗(yàn)方法
3.1樣品前處理方法
（1） 標(biāo)準(zhǔn)樣品配制：
取50mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，以20%甲醇溶解定容至50mL得到1000ppm的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時(shí)，以提取液（0.1%三氯YI SUAN）稀釋至所要的濃度。
（2） 提?。?br /> 稱取飼料樣品5g，加入50ml 0.1%三氯乙SUAN提取液，充分混勻，加入2mL 2%乙酸鉛溶液，超聲20min。然后取部分溶液轉(zhuǎn)移至10mL離心管中，8000rpm/min離心10min，取上清液3mL過(guò)混合型陽(yáng)離子交換小柱（PCX）。
（3） 凈化（PCX小柱，60mg/3mL） ：
a） 活化及平衡：3mL甲醇，3mL水
b） 上樣：加入提取液3mL
c） 淋洗：3mL水；3mL 甲醇；棄去淋洗液并將小柱抽干。
d） 洗脫：5mL 5%氨化甲醇（v/v）洗脫。（5%氨化甲醇的配制：5mL氨水+95mL甲醇）。
e） 濃縮：50℃，氮?dú)獯蹈桑?0%甲醇/水定容至2mL，HPLC分析或衍生后GC/MS分析。
a） 活化及平衡：3mL甲醇，3mL水
b） 上樣：加入提取液3mL
c） 淋洗：3mL水；3mL 甲醇；棄去淋洗液并將小柱抽干。
d） 洗脫：5mL 5%氨化甲醇（v/v）洗脫。（5%氨化甲醇的配制：5mL氨水+95mL甲醇）。
e） 濃縮：50℃，氮?dú)獯蹈桑?0%甲醇/水定容至2mL，HPLC分析或衍生后GC/MS分析。
3.2 HPLC檢測(cè)方法
3.2.1 三聚氰胺HPLC-UV檢測(cè)方法
三聚氰胺是強(qiáng)極性化合物，在傳統(tǒng)的反相C18柱上保留很差，需要用離子對(duì)試劑色譜方法才能有良好的保留與分離，按照美國(guó)食品（FDA）的三聚氰胺檢測(cè)方法和中國(guó)公布的三聚氰胺檢測(cè)方法，采用親水色譜柱，可以得到良好的分離效果，分析色譜圖如下：
圖2 色譜柱分離三聚氰胺的譜圖
（a） 色譜柱：Venusil ASB C8 4.6×250mm；標(biāo)準(zhǔn)：FDA方法；流動(dòng)相：緩沖液：乙腈=85：15；緩沖液：10mM檸檬酸，10mM辛烷磺酸鈉，調(diào)pH為3.0；流速：1.0mL/min；柱溫：40 oC；波長(zhǎng)：240nm
（b） 色譜柱：Venusil ASB-C18 4.6×250mm；標(biāo)準(zhǔn)：中國(guó)頒標(biāo)準(zhǔn)方法；緩沖液：10mM檸檬酸, 10mM庚烷磺酸鈉；流動(dòng)相：緩沖溶液:乙腈=85:15；流速：1.0mL/min;柱溫：40℃；波長(zhǎng)：240nm
空白加水平（mg/L） 回收率
0.01 116%
0.1 108%
0.5 92%
2 96%
（b） 色譜柱：Venusil ASB-C18 4.6×250mm；標(biāo)準(zhǔn)：中國(guó)頒標(biāo)準(zhǔn)方法；緩沖液：10mM檸檬酸, 10mM庚烷磺酸鈉；流動(dòng)相：緩沖溶液:乙腈=85:15；流速：1.0mL/min;柱溫：40℃；波長(zhǎng)：240nm
空白加水平（mg/L） 回收率
0.01 116%
0.1 108%
0.5 92%
2 96%
由上表1可以看出：用PCX柱凈化樣品，可以得到滿意的回收率，此方法處理樣品，比FDA公布的前處理方法更加準(zhǔn)確、可靠。
3.2.2 三聚氰胺LC-MS檢測(cè)方法
由于FDA公布的HPLC-UV方法中，流動(dòng)相添加了離子對(duì)試劑，因此限制了液質(zhì)聯(lián)用方法的使用；但不用離子對(duì)試劑色譜方法，三聚氰胺在傳統(tǒng)的C18柱上保留很差，不能得到較好的分離定量〔3〕。
基于此問(wèn)題，艾杰爾科技公司自主開(kāi)發(fā)了新的方法，采用艾杰爾（Agela） ASB系列親水色譜柱，不用離子對(duì)試劑也能得到有效的保留與分離。因此方法中流動(dòng)相不含離子對(duì)試劑，可以用于質(zhì)譜檢測(cè)。
與FDA 2007年4月公布的《Updated FCC Developmental Melamine Quantitation （HPLC-UV）》相比較，該方法大大降低了zui低檢測(cè)限（MSD：0.5ppm；UV：2ppm），提高了檢測(cè)靈敏度。
基于此問(wèn)題，艾杰爾科技公司自主開(kāi)發(fā)了新的方法，采用艾杰爾（Agela） ASB系列親水色譜柱，不用離子對(duì)試劑也能得到有效的保留與分離。因此方法中流動(dòng)相不含離子對(duì)試劑，可以用于質(zhì)譜檢測(cè)。
與FDA 2007年4月公布的《Updated FCC Developmental Melamine Quantitation （HPLC-UV）》相比較，該方法大大降低了zui低檢測(cè)限（MSD：0.5ppm；UV：2ppm），提高了檢測(cè)靈敏度。
緩沖液：10mM的NH4AC；流動(dòng)相：Buffer:：ACN=95：5；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：樣品先用70%ACN溶解成約1mg/mL，用ACN稀釋成0.1mg/mL，進(jìn)10uL；柱溫：40℃；波長(zhǎng)：240nm
4 結(jié)果與討論
4 結(jié)果與討論
4.1陽(yáng)離子交換柱（PCX）
三聚氰胺呈弱堿性（弱陽(yáng)離子化合物），凈化過(guò)程一般應(yīng)選擇陽(yáng)離子交換柱?；旌闲偷年?yáng)離子交換柱（PCX）通過(guò)將磺酸基團(tuán)（-SO3H）鍵合在極性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯（PEP）吸附劑上，具有陽(yáng)離子交換和反相吸附兩種機(jī)理，并具有以下優(yōu)點(diǎn)：
a） 可通過(guò)兩種不同溶液的洗滌（水/一定pH值的緩沖溶液和有機(jī)溶劑），使樣品更干凈，提高檢測(cè)的靈敏度。
b） 批次重復(fù)性好。
c） 回收率高，重現(xiàn)性好，即使小柱跑干也可以得到較高回收率。
a） 可通過(guò)兩種不同溶液的洗滌（水/一定pH值的緩沖溶液和有機(jī)溶劑），使樣品更干凈，提高檢測(cè)的靈敏度。
b） 批次重復(fù)性好。
c） 回收率高，重現(xiàn)性好，即使小柱跑干也可以得到較高回收率。
4.2 LC-MS方法優(yōu)點(diǎn)：
（1）檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)便：無(wú)須添加離子對(duì)試劑，三聚氰胺就可得到良好的保留與分離，避免了配制離子對(duì)流動(dòng)相的復(fù)雜過(guò)程。
（2）提高了檢測(cè)的靈敏度：無(wú)離子對(duì)試劑，可以用于質(zhì)譜檢測(cè)器，大大降低了zui低檢測(cè)限（MSD：0.5ppm；UV：2ppm）。
（3）降低了檢測(cè)成本：不用離子對(duì)試劑，就不再需要買價(jià)格較貴的離子對(duì)試劑了，從而降低了檢測(cè)成本。
（4）延長(zhǎng)了色譜柱的使用壽命：避免了使用離子對(duì)試劑減少色譜柱壽命的影響。
（5）該方法所使用的色譜柱具有通用性：無(wú)論是用FDA方法、中國(guó)部頒標(biāo)準(zhǔn)方法和本公司開(kāi)發(fā)的LC-MS方法，使用艾杰爾（Agela） ASB系列親水色譜柱均能得到一個(gè)很好的檢測(cè)結(jié)果，從而給客戶提供了多種選擇空間。
（2）提高了檢測(cè)的靈敏度：無(wú)離子對(duì)試劑，可以用于質(zhì)譜檢測(cè)器，大大降低了zui低檢測(cè)限（MSD：0.5ppm；UV：2ppm）。
（3）降低了檢測(cè)成本：不用離子對(duì)試劑，就不再需要買價(jià)格較貴的離子對(duì)試劑了，從而降低了檢測(cè)成本。
（4）延長(zhǎng)了色譜柱的使用壽命：避免了使用離子對(duì)試劑減少色譜柱壽命的影響。
（5）該方法所使用的色譜柱具有通用性：無(wú)論是用FDA方法、中國(guó)部頒標(biāo)準(zhǔn)方法和本公司開(kāi)發(fā)的LC-MS方法，使用艾杰爾（Agela） ASB系列親水色譜柱均能得到一個(gè)很好的檢測(cè)結(jié)果，從而給客戶提供了多種選擇空間。
參考文獻(xiàn)
〔1〕 W.C.Andersen, S.B. Turnipseed, Determination of Melamine Residues in Catfish Tissue by Triple Quadrupole LC-MS-MS with HILIC Chromatography. Laboratory Information Bulletin. vol. 23, No. 4396 ,2007,
〔2〕 D.W. Hamilton, P.A. O’Neal, Analytical methods for the quantification of free melaminecyanuric acid in Nylon 6/6,6 copolymer. J. Sep. Sci., vol.26, pp.510
〔1〕 W.C.Andersen, S.B. Turnipseed, Determination of Melamine Residues in Catfish Tissue by Triple Quadrupole LC-MS-MS with HILIC Chromatography. Laboratory Information Bulletin. vol. 23, No. 4396 ,2007,
〔2〕 D.W. Hamilton, P.A. O’Neal, Analytical methods for the quantification of free melaminecyanuric acid in Nylon 6/6,6 copolymer. J. Sep. Sci., vol.26, pp.510
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